НОВЫЙ  СПОСОБ  ПОЛУЧЕНИЯ  МИКОЗАМИНА  —  МОДЕЛЬНОГО  СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ  РАЗРАБОТКИ  СИНТЕТИЧЕСКИХ  НАПРАВЛЕНИЙ  ХИМИЧЕСКОЙ  МОДИФИКАЦИИ  ПОЛИЕНОВЫХ МАКРОЛИДНЫХ  АНТИБИОТИКОВ

Белахов  Валерий  Владимирович

канд.  хим.  наук,

  вед.  науч.  сотр.  Технион  —  Израильский  институт  технологии 

(химический  факультет),

  Хайфа,  Израиль 

E-mail:  chvalery@techunix.technion.ac.il

Ионин Борис  Иосифович

д-р.  хим.  наук,  профессор,

  Санкт-Петербурский  технологический  институт 

(Технический  университет), 

г.  Санкт-Петербург,  Россия

E-mail:  borisionin@mail.ru

NEW  METHOD  OF  PREPARATION OF  MYCOSAMINE  AS  A  MODEL  COMPOUND FOR  THE  DEVELOPMENT OF  SYNTHETIC  PATHWAYS OF  CHEMICAL  MODIFICATION OF  POLYENE  MACROLIDE  ANTIBIOTICS

Valery  V.  Belakhov

Ph.  D.  (Chemistry),  Senior  Research  Scientist,  Faculty  of  Chemistry,  Technion  —  Israel  Institute  of  Technology,  Haifa,  Israel

Boris  I.  Ionin

Dr.  Sc.  (Chemistry),  Professor  Department  of  Organic  Chemistry,  Saint-Petersburg  State  Technological  Institute  (Technical  University),  Saint-Petersburg,  Russia

AHHOTAЦИЯ

Разработан  новый  метод  получения  микозамина  (3-амино-3,6-дидезокси-D-манноза)  —  модельного  соединения  для  разработки  синтетических  направлений  химической  модификации  полиеновых  макролидных  антибиотиков.  Разработанный  метод  позволяет  получить  аналитически  чистый  микозамин  с  высоким  выходом. 

ABSTRACT

The  new  method  of  the  preparation  of  mycosamine  (3-amino-3,6-dideoxy-D-mannose)  as  a  model  compound  for  the  creation  of  synthetic  pathways  of  chemical  modification  of  polyene  macrolide  antibiotics  was  developed.  The  developed  method  allows  to  prepare  analytically  pure  mycosamine  with  high  yield.

Ключевые  слова:  микозамин;  полиеновые  макролидные  анти­биотики;  химическая  модификация;  полусинтетические  производные.

Keywords:  mycosamine;  polyene  macrolide  antibiotics;  chemical  modification;  semisynthetic  derivatives. 

Работа  выполнена  при  финансовой  поддержке  Министерства  образования  и  науки  РФ  в  рамках  Федеральной  целевой  программы  «Научные  и  научно-педагогические  кадры  инновационной  России»  на  2009—2013  годы  по  теме  «Создание  новых  полусинтетических  производных  и  модификация  существующих  полиеновых  макролидных  антибиотиков  с  целью  получения  высокоэффективных  противо­грибковых  лекарственных  препаратов»  (государственный  контракт  №  2012-1.5-12-000-1013-005).

1. Введение

Полиеновые  макролидные  антибиотики  (ПМА)  амфотерицин  В,  леворин,  нистатин,  пимарицин,  кандицидин,  микогептин  и  другие  широко  применяются  в  медицинской  практике  для  лечения  микозов  [8,  5,  14].  Известно,  что  ПМА  являются  полифункцио­нальными  соединениями,  которые  характеризуются  большими  размерами  лактонного  кольца  (от  26  до  33  атомов)  и  наличием  сопряженых  двойных  связей  (от  4  до  7)  [11,  1].  По  числу  двойных  связей  ПМА  подразделяются  на  тетраены,  пентаены,  гексаены  и  гептаены.  Молекулы  ПМА  принято  подразделять  на  две  части:  жесткую  непредельную  часть  макролактонного  цикла,  обладающую  гидрофобными  свойствами,  и  подвижную  —  полиольную  часть,  обуславливающую  гидрофильность  молекулы.  Другими  важными  структурными  компонентами  ПМА  являются  карбоксильная  группа  и  аминогруппа,  входящая  в  состав  углеводного  фрагмента.  В  большинстве  изученных  ПМА  содержится  аминосахарид-микозамин  (3-амино-3,6-дидезокси-D-манноза).  Следовательно,  подавляющее  количество  полусинтетических  производных  ПМА  получено  в  результате  химической  модификации  этих  противогрибковых  препаратов  по  аминогруппе  или  карбоксильной  группе  [3,  4,  2]. 

В  настоящей  работе  разработан  метод  получения  микозамина  с  целью  последующего  применения  его  в  качестве  модельного  соединения  для  разработки  новых  синтетических  направлений  химической  модификации  ПМА.

2. Экспериментальная  часть

Использовали  амфотерицин  В  производства  “Sigma”  (США)  с  биологической  активностью  740  ЕД/мг,  с  удельными  показателями  поглощения  (Е^1%_1см)  782,  1373  и  1564  при  длинах  волн  362,  383  и  405  нм.  соответственно.  Органические  растворители  очищали  в  соответствии  с  методиками,  описанными  в  [6].  Для  очистки  реакционной  смеси  использовали  катионит  Dowex  H⁺  в  водородной  форме  (Dowex  H⁺  50Wx8-400,  размер  частиц  200—400  мкм,  “Sigma”,  США).  Спектры  ЯМР  (¹Н  и  ¹³С)  получены  на  приборе  “Bruker  Аvance”  (Германия)  с  рабочей  частотой  500  МГц.  Исследовали  10—15  %  растворы  в  МеОD-d₄,  внутренний  эталон  —  ТМС.  Контроль  за  ходом  реакции  и  индивидуальность  соединений  контролировали  с  помощью  тонкослойной  хроматографии  (ТСХ)  на  пластинах  Silica  Gel  60  F₂₅₄  (0,25  мм,  “Merck”,  Германия)  в  системе  растворителей:  метиламин  (33  %  раствор  в  этаноле)  —  хлористый  метилен-метанол-вода,  MeNH₂-CH₂Cl₂-MeOH-H₂O,  15:10:15:6.  Вещества  определяли  на  хрома­тограммах  с  помощью  специального  проявляющего  раствора,  содержащего  молибдат  аммония  120  г  (NH₄)₆Mo₇O₂₄^.4H₂O  и  5  г  церий  (IV)  аммония  нитрат  (NH₄)₂Ce(NO₃)₆  в  10  %  серной  кислоте  H₂SO₄. 

Методика  получения  микозамина  (3-амино-3,6-дидезокси-D-манноза).

250  мл  сухого  метанола  охладили  до  температуры  –10^оС,  а  затем  добавляли  в  течение  30  мин  капельно  125  мл  ацетилхлорида.  Реакцию  проводили  при  интенсивном  перемешивании  в  атмофере  аргона.  После  окончания  добавления  ацетилхлорида  реакционную  смесь  выдержи­вали  при  перемешивании  при  температуре  –10^оС  в  течение  30  мин,  а  затем  ещё  —  30  мин  при  комнатной  температуре.  После  этого  при  комнатной  температуре  к  реакционной  смеси  добавили  25  г  (0,027  мол)  амфотерицина  В  и  перемешивали  полученную  суспензию  в  течение  30  мин  при  комнатной  температуре,  а  затем  проводили  реакцию  при  интенсивном  перемешивании  при  температуре  50^оС  в  атмосфере  аргона.  По  данным  ТСХ  реакция  завершилась  через  3  ч.  Реакционную  смесь,  представляющую  собой  суспензию,  охладили  до  комнатной  температуры,  а  затем  поместили  в  холодильник  для  охлаждения  до  температуры  4^оС  в  течение  5  ч.  После  этого  реакционную  смесь  фильтровали,  полученный  фильтрат  концен­трировали  с  помощью  ротационного  испарителя,  остаток  промывали  метанолом  с  последующим  концентрированием  при  пониженном  давлении.  Полученный  остаток  растворяли  в  50  мл  дистиллированной  воды  и  подавали  на  хроматографическую  колонну,  содержащую  катионит  Dowex  H⁺.  После  этого  колонну  промывали  с  исполь­зованием  следующих  растворителей  или  их  смесей:  1)  метанол  —  дистиллированная  вода,  1:  1;  2)  дистиллированная  вода;  3)  1  %  водный  раствор  гидрооксиси  аммония  (NH₄OH).  Целевой  продукт  элюировали  с  колонны  с  помощью  5—10  %  водного  раствора  гидроокиси  аммония.  Контроль  фракций,  выходящих  из  колонны,  проводили  с  помощью  ТСХ.  Элюаты,  содержащие  целевой  продукт,  объединяли  и  концент­рировали  в  вакууме,  остаток  сушили  в  вакууме  при  30^оС  в  течение  4  ч.  Получили  микозамин  в  виде  мелких  белых  кристаллов,  выход  3,83  г  (87  %). 

3.  Результаты  и  их  обсуждение

Ранее  различными  исследователями  был  предложены  методы  получения  микозамина,  основанные  на  проведении  кислотного  гидролиза  ПМА  в  водно-спиртовой  среде  [10—12].  Основными  недостатками  этих  методов  являлись:  1)  низкий  выход  микозамина,  связанный  с  использованием  сильных  минеральных  кислот  (серной  или  соляной),  что  приводило  к  образованию  значительных  количеств  продуктов  деструкции  ПМА;  2)  длительный  и  сложный  способ  выделения  и  очистки  микозамина.  Нами  разработан  метод  получения  микозамина,  включающий  кислотный  гидролиз  амфотерицина  В  в  более  мягких  условиях  с  последующей  очисткой  микозамина  с  помощью  ионообменной  хроматографии,  позволяющей  получать  высокоочищенный  целевой  продукт  (схема  1).

Схема  1.  Получение  микозамина

Параметры  спектров  ЯМР  (¹Н  и  ¹³С)  полученного  микозамина,  а  также  его  физико-химические  характеристики  согласуются  с  литературными  данными  [7,  9]. 

Вывод

Разработан  новый  метод  получения  микозамина  —  модельного  соединения  для  разработки  синтетических  путей  химической  модификации  ПМА  с  использованием  первичной  аминогруппы,  которая  является  важной  функциональной  группой  молекул  этих  противогрибковых  препаратов  и  проявляет  высокую  реакционную  способность. 

Список  литературы:

1. Ветлугина  Л.А.,  Никитина  Е.Т.  Противогрибковые  полиеновые  анти­биотики.  Алма-Ата:  Наука.  —  1980.  —  248  С.

2. Соловьева  С.Е.,  Олсуфьева  Е.Н.,  Преображенская  М.Н.  Химическое  модифицирование  противогрибковых  макролидных  полиеновых  антибиотиков  //  Успехи  химии.  —  2011.  —  Т.  80.  —  №  2.  —  C.  115—138. 

3. Шенин  Ю.Д.,  Белахов  В.В.,  Аравийский  Р.А.  Нистатин:  методы  получения,  поиск  производных  и  перспективы  медицинского  применения  //  Химико-фармацевтический  журнал.  —  1993.  —  Т.  27.  —  №  2.  —  С.  14—21. 

4. Шенин  Ю.Д.,  Белахов  В.В.  Амфотерицин  В:  свойства,  химическое  строение,  поиск  производных  //  Антибиотики  и  химиотерапия.  —  1997.  —  Т.  42.  —  №  4.  —  C.  34—46.

5. Antifungal  Agents:  Advances  and  Problems,  Special  Topic:  Progress  in  Drug  Research.  //  Jucker  E.  (Editor).  Basel:  Birkhaeuser  Verlag.  —  2003.  —  248  P.

6. Armarego  W.L.F.,  Chai  C.L.L.  Purification  of  Laboratory  Chemicals.  Oxford:  Butterworth-Heinemann  Press.  —  2012.  —  1024  P.

7. Ceder  O.,  Hanson  B.  Pimaricin  VIII.  Structural  and  Configurational  Studies  by  Electron  Impact  and  Field  Desorption  Mass  Spectrometry,  13C  (25,3  MHz)  and  1H  (270  MHz)  —  NMR  Spectroscopy  //  Tetrahedron.  —  1977.  —  Vol.  33.  —  №  20.  —  P.  2703—2714.

8. Macrolide  Аntibiotics:  Сhemistry,  Biology  and  Practice.  /  Omura  S.  (Ed.).  New  York:  Academic  Press.  —  2002.  —  635  P.

9. Lancelin  J.M.,  Beau  J.M.  Stereostructure  of  Glycosylated  Polyene  Macrolides:  the  Example  of  Pimaricin  //  Bulletin  de  la  Societe  Chimique  de  France.  —  1995.  —  Vol.  132.  —  №  2.  —  P.  215—223. 

10. Stefanska  B.,  Troka  E.,  Falkowski  L.  The  Amadori  Reaction  of  Benzyl-Mycosaminide  with  D-Glycose  and  D-Mannose  //  Polish  Journal  of  Chemistry.  —  1983.  —  Vol.  57.  —  №  1—3.  —  P.  309—313.

11. Tereshin  I.M.  Polyene  Antibiotics  —  Present  and  Future.  Tokyo:  University  Tokyo  Press.  —  1976.  —  144  P.

12. Tunac  J.B.,  McDaniel  L.E.,  Patel  M.,  Schaffner  C.P.  Hydroheptin:  A  Water-Soluble  Polyene  Macrolide.  II.  Chemical  and  Biological  properties  //  Journal  of  Antibiotics.  —  1979.  —  Vol.  32.  —  №  12.  —  P.  1230—1238.

13. Tweit  R.C.,  Pandey  R.C.,  Rinehart  K.L.  Characterization  of  the  Antifungal  and  Antiprotozoal  Antibiotic  Partricin  and  Structural  Studies  on  Partricins  A  and  B  //  Journal  of  Antibiotics.  —  1982.  —  Vol.  35.  —  №  8.  —  P.  997—1012.

14. Zotchev  S.B.  Polyene  Macrolide  Antibiotics  and  Their  Application  in  Human  Therapy  //  Current  Medicinal  Chemistry.  —  2003.  —  Vol.  10.  —  №  3.  —  P.  211—223.