НОВЫЕ  ВОЗМОЖНОСТИ  КЛЕТОЧНОЙ  ТЕРАПИИ

Николаева  Людмила  Петровна

канд.  мед.  наук,  кафедра  «Хирургии»,  Красноярский  государственный  медицинский  университет  им.  проф.  Войно-Ясенецкого,  Министерства  здравоохранения  РФ  г.  Красноярск

E-mail: 

NEW  OPPORTUNITIES  OF  CELL-BASED  THERAPY

Lyudmila  Nikolaeva

candidate  of  Medical  Science  of  the  chair  of  Surgery,  Krasnoyarsk  State  Medical  University  named  after  professor  Voyno-Yasenetsky,  Ministry  of  Healthcare  of  the  Russian  Federation,  Krasnoyarsk

АННОТАЦИЯ

У  больных  с  критической  ишемией  нижних  конечностей  во  время  вынужденной  ампутации,  удаляется  не  только  конечность,  но  и  около  25  %  всех  стволовых  клеток  (СК),  что  значительно  снижает  возможности  организма  к  восстановлению.  Содержание  стволовых  клеток  в  костном  мозге  бедренной  кости  соответствует  терапевтической  дозе  и  может  использоваться  для  аутологической  трансплантации  данному  больному.  Мононуклеарные  фракции  костного  мозга  ампутированной  конечности,  полученные  в  стерильных  условиях  операционной,  могут  в  течение  1,5—2  часов  быть  готовы  к  применению.

ABSTRACT

Patients  with  critical  ischemia  of  lower  extremities  during  forced  amputation  have  not  only  an  extremity  extirpated  but  also  about  25  %  of  all  stem  cells  (S.C.)  that  remarkably  reduces  organism  abilities  to  recovery.  Content  of  stem  cells  in  bone  marrow  of  a  femoral  bone  corresponds  to  a  curative  dose  and  could  be  used  for  autologous  transplantation  to  the  particular  patient.  Bone  marrow  mononuclear  fractions  of  a  stump  received  in  sterile  conditions  of  an  operative  room  could  be  ready  for  use  during  1,5—2  hours. 

Ключевые  слова:  стволовые  клетки;  клеточная  терапия;  гемопоэтическая  стволовая  клетка;  аутотрансплантация;  клеточная  трансплантация.

Keywords:  stem  cells;  cell-based  therapy;  hematopoietic  stem  cells;  autotransplantation;  cell  transplantation.

Приблизительно  40—60  %  всех  нетравматических  ампутаций  нижних  конечностей  проводится  у  больных  диабетом.  У  80  %  больных  сахарным  диабетом  спустя  15—20  лет  после  начала  болезни  ампутируются  одна  или  обе  нижние  конечности.  В  40  %  наблюдений  после  первой  ампутации  на  уровне  бедра  или  голени  больные  теряют  подвижность  и  могут  передвигаться  только  в  пределах  квартиры.  С  увеличением  возраста  больных  прослеживается  тенденция  увеличения  доли  больших  ампутаций,  так  у  лиц  возрастной  категории  65—74  года  ампутации  голени  и  бедра  составляют  32  %  и  18  %,  среди  лиц  старше  75  лет  34  %  и  28  %  соответственно.  Уровень  ампутации  определяет  летальность.  Ампутация  конечности  —  операция,  травматичная  как  для  самого  больного,  так  и  для  его  семьи.  Высокие  ампутации  приводят  к  ограничению  социальной  адаптации  пациентов,  существенно  сокращают  продолжительность  жизни  больных  в  результате  поражения  контралатеральной  конечности  и  присоединения  различного  рода  осложнений.  Нижняя  конечность,  удаляемая  во  время  вынужденной  ампутации,  это  важное  депо  костного  мозга,  где  в  полости  бедренной  кости  находится  около25  %  всего  костного  мозга  данного  пациента.  Важной  особенностью  костного  мозга  является  его  одновременная  принадлежность  двум  регуляторным  системам  организма  —  системе  крови  и  иммунной  системе,  клетки  которых  участвуют  в  обеспечении  адаптивных  реакций.  В  настоящее  время  доказано,  что  восстановление  поврежденного  органа  происходит  не  только  за  счет  активации  органных  регионарных  стволовых  клеток,  но  и  за  счет  миграции  в  зону  повреждения  мезенхимальных  стволовых  клеток  из  других  органов,  и  прежде  всего  из  костного  мозга.  Если  при  операции,  например  ампутации  конечности  на  уровни  бедра,  удаляется  до  25  %  всего  костного  мозга,  то  возможности  к  репарации  и  восстановлению  снижены  из-за  уменьшения  количества  клеток  отвечающих  за  это.  Иммунная  система  при  ампутации  конечности  сокращена  на  четверть  и  как  долго  сохранится  созданный  иммунодефицит  зависит  от  индивидуальных  особенностей  пациента.  Важно,  во  время  проведения  вынужденной  ампутации  конечности,  снизить  потери  костного  мозга  за  счет  аутологичной  клеточной  терапии.  Применение  тканевых  и  клеточных  технологий  уже  вышло  из  разряда  доклинических  исследований.  Ближайшая  задача  биомедицинских  исследований  в  этой  области  –  применение  высоких  клеточных  технологий  [1,  с.  3].  Получение  стволовых  клеток  путем  культивирования  имеет  несколько  общеизвестных  недостатков  и  в  первую  очередь  опасность  отторжения.  Большинство  известных  технологий  взятия  костного  мозга  у  живых  лиц  с  целью  последующей  трансплантации  ткани  костного  мозга  или  выделенного  концентрата  стволовых  клеток  предполагает  использование  методик  инвазивной  трепанобиопсии  [2,  с.  352].  Впервые  стволовые  клетки  были  обнаружены  именно  в  костном  мозге  и  долгое  время  считалось,  что  основное  депо  стволовых  клеток  является  именно  костный  мозг.  В  последние  годы  во  всем  мире  началось  интенсивное  изучение  стволовых  клеток  из  различных  источников.  Было  показано,  что  стволовые  клетки  присутствуют  в  любой  ткани  и  органе:  в  печенее,  селезенке,  жировой  ткани  и  пр.  Вместе  с  тем,  в  практике  хирургических  стационаров  достаточно  часто  приходится  иметь  дело  с  необходимостью  проведения  ампутаций  конечностей.  По  статистическим  данным  в  США  ампутации  нижних  конечностей  ежегодно  проводятся  примерно  у  150000  человек  [6,  с.  188].  Предполагается,  что  среди  прочих  равных  обстоятельств,  определенное  значение  в  этом  имеет  и  факт  утраты  вместе  с  костно-мозговой  тканью,  находящейся  в  ампутированной  кости,  до  25  %  всего  количества  стволовых  клеток  пациента  [3,  с.  350].  Полученную  в  результате  вынужденной  операции  костномозговую  ткань  рассматривать  как  один  возможных  источников  стволовых  клеток,  в  том  числе  и  с  целью  последующей  аутотрансплантации.  В  настоящее  время  клеточная  терапия  применяется  при  многих  заболеваниях,  которые  ранее  считались  неизлечимыми.  Лечение  стволовыми  клетками  возможно  при  1  и  2  типе  сахарного  диабета.  Для  лечения  сахарного  диабета  применяются  стволовые  клетки,  полученные  из  костного  мозга.  При  получении  стволовых  клеток  из  ампутированной  конечности  (что  часто  наблюдается  при  сахарном  диабете),  можно  использовать  их  для  данного  больного  с  целью  улучшения  качества  жизни  больного  и  профилактики  осложнений  диабета.

Целью  исследования:

Возможность  выделения  стволовых  клеток,  полученных  из  костного  мозга  бедренной  кости  ампутированной  конечности.  Провести  сравнительную  оценку  полученных  результатов  с  традиционной  костно-мозговой  пункцией.  Поставленную  задачу  решают  за  счет  того,  что  в  операционной,  непосредственно  после  ампутации,  извлекают  костный  мозг  из  костно-мозгового  канала  бедренной  кости  в  стерильную  емкость  с  последующей  транспортировкой  в  лабораторию. 

Материалы  и  методы:

Выделение  клеток  костного  мозга:  костномозговую  массу  объемом  3  мл  гомогенизировали  в  4  мл  PBS.  Полученную  суспензию  пропускали  через  нейлоновый  фильтр  с  порами  40  мкм.  Три  раза  клетки  отмывали  PBS  центрифугированием  5  мин  при  900  g.  Клетки  разводили  PBS  до  конечной  концентрации  600  тыс.  в  1  мл.  Определение  CD34+  клеток:  CD34+  определяли  на  проточном  цитофлюориметре  BD  FACSCanto  II  по  стандартной  методике.  В  качестве  флюоресцентной  метки  использовались  меченые  FITC  антитела  (BD)  к  CD34,  отрицательный  контроль  —  антитела  меченые  FITC  к  мышиным  IgG1  (BD).  CD34+  клетки  считали  от  числа  всех  клеток  в  суспензии  [5,  с.  335].

Содержание  стволовых  клеток  в  костном  мозге,  полученном  из  ампутированной  конечности,  намного  выше,  чем  количество  стволовых  клеток,  полученных  при  пункции.  Проведено  15  исследований  ампутированной  конечности.  Количество  стволовых  клеток,  полученных  при  пункции,  не  превышает  0,1  %  [4,  с.  283],  а  количество  стволовых  клеток,  полученных  из  ампутированной  конечности,  больше  в  несколько  десятков  раз  (до  40). 

Результаты:

1.  большой  объем  костного  мозга  (в  сравнении  с  пункцией);

2.  техническая  простота  взятия  материала;

3.  высокое  содержание  стволовых  клеток  в  костном  мозге  ампутированной  конечности  (возможность  клеточной  терапии  без  культивирования);

4.  больной  не  подвергается  пункции.

Ни  один  из  существующих  на  данный  момент  источников  СК  человека  или  методов  их  получения  не  может  полностью  обеспечить  потребности  исследователей  и  требования  клиницистов.  Получение  взрослых  СК  ассоциировано  с  применением  инвазивных,  травмирующих,  болезненных  для  донора  (не  без  риска  осложнений)  и,  что  немаловажно,  дорогостоящих  процедур.  Все  это,  безусловно,  ограничивает  экспериментальные  исследования  СК  человека  и  тормозит  внедрение  клеточных  технологий  в  клиническую  практику.  Ампутированную  конечность,  полученную  в  результате  вынужденной  операции,  можно  рассматривать  как  один  из  наиболее  доступных  источников  стволовых  клеток.  Способность  к  дифференцировке  в  различные  клеточные  типы  делает  СК  перспективными  с  точки  зрения  возможного  использования  для  клеточной  терапии  целого  ряда  приобретенных  и  наследственных  заболеваний.  При  введении  в  системный  кровоток  СК  способны  целенаправленно  мигрировать  в  участок  поражения  [7,  с.  1919]. 

Применение  аутотрансплантации  МСК  кажется  наиболее  перспективными  на  данном  этапе  развития  клинической  науки,  так  как  оно  позволяет  избежать  этических  и  иммунных  проблем,  связанных  с  трансплантацией  от  донора  к  реципиенту.  Кроветворные  стволовые  клетки  уже  на  протяжении  трех  десятилетий  используются  для  восстановления  кроветворения  у  пациентов  с  онкологическими  и  гематологическими  заболеваниями.  Активно  разрабатываются  подходы  к  применению  трансплантации  стволовых  клеток  при  лечении  заболеваний,  которые  до  последнего  времени  считались  неизлечимыми  с  помощью  традиционных  подходов  [8,  с.  63].  Ампутация  нижней  конечности  должна  проводиться  с  учетом  достижений  современной  науки  и  снизить  ее  повреждающий  эффект  необходимо  в  интересах  больного.

Список  литературы:

1.Пальцев  М.А.  Медицина  ХХI  века  в  свете  клеточной  биологии  //  Вести.  РАМН.  —  2004.  —  №  9.  —  С.  3—11. 

2.Питерс-Хармел  Э.,  Матур  Р.  Сахарный  диабет:  диагностика  и  лечение.  М.:  ИД  «Практика»,  2008.  2.  Руководство  по  лабораторной  гематологии  /  Б.  Сисла;  пер.  с  англ.  под  общ.  ред.  А.И.  Воробьева  М.:  Практическая  медицина,  2011.  —  352  с.

3.Руководство  по  лабораторной  гематологии  /.Б.  Сисла;  пер.  с  англ.  под  общ.  ред.  А.И.  Воробьева  М.:  Практическая  медицина,  2011.  —  350  с.

4.Bruder  S.P.,  Fink  D.J.,  Caplan  A.I.  Mesenchymal  stem  cells  in  bone  development,  bone  repair,  and  skeletal  regeneration  therapy//  J.  Cell.  Biochem.  —  1994.  —  Vol.  56.  —  P.  283—294.

5.Jamshidi  K.,  Swaim  W.R.  Bone  marrow  biopsy  with  unaltered  architecture:  A  new  biopsy  device.  J.  Lab.  Clin.  Med.  77:335,  1971.

6.Krause  J.  Bone  marrou  overview.  In:  Rodak  B,  ed.  Hematology:  Clinical  Procedures  and  Appllications,  2^nd  ed.  Philadelphia:  WB  Saunders,  2002;  188—195.

7.Shake  J.G.,  Gruber  P.J.,  Baumgartner  W.A.  et  al.  Mesenchimal  stem  cell  implantation  in  a  swine  myocardial  infarct  model:  engraftment  and  functional  effects  //  Ann.  Thorac.Surg.  —  2002.  —  Vol.  73.  —  P.  1919—1956. 

8.Weaver  C.V.,  Garry  D.G.  Regenerative  biology:  a  historical  perspective  and  modern  applications  //  Regenerative  Medicine.  —  2008.  —  Vol.  3,  —  №  1.  —  P.  63—82.