ПОТЕНЦИРОВАНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ ЦИКЛОФОСФАНА НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫМ ПЕКТИНОМ

POTENTIATION OF ANTITUMOR ACTIVITY OF CYCLOPHOSPHAMIDE LOW-MOLECULAR PECTIN

Indira Kudaibergenova

head of Department of Oncology, Doctor of Health Science , Professor, Department of Oncology, I.K. Akhunbaev Kyrgyz State Medical Academy,

Kyrgyzstan, Bishkek

Boris Lepshin

senior researcher, Cand. ofScience., Department of Oncology, I.K. Akhunbaev Kyrgyz State Medical Academy,

Kyrgyzstan, Bishkek

Iskander Chakeev

senior researcher, Cand. ofScience,Department of Oncology, I.K. Akhunbaev Kyrgyz State Medical Academy,

Kyrgyzstan, Bishkek

Nadyrbek Alimjanov

researcher, Department of Oncology, I.K. Akhunbaev Kyrgyz State Medical Academy,

Kyrgyzstan, Bishkek

Vladimir Krasnoshtanov

senior researcher, Cand. of Science, Kazakh Scientific researchInstitute of Oncology and Radiology,

Kazakhstan, Almaty

АННОТАЦИЯ

В статье представлены результаты скрининга противоопухолевой активности низкомолекулярного пектина на экспериментальной опухоли Уокера 256. На основании разработанной методики определён характер взаимодействия пектина с конвенциальным цитостатиком – циклофосфаном. На репрезентативной выборке показано, что результат такого взаимодействия проявляется в виде потенцирования противоопухолевого эффекта.

ABSTRACT

The article presents the results of the screening antitumor activity of low molecular weight pectin in experimental tumor Walker 256. On the basis of the developed technique identifies the nature of the interaction of pectin with the conventional cytostatic – cyclophosphamide. On a representative sample shows that the result of this inter-action is manifested in the form of potentiation of antitumor effect.

Ключевые слова: скрининг противоопухолевой активности;низкомолекулярный пектин; карциносаркома Уокера 256; синергия; потенцирование.

Keywords: screening antitumor activity; low molecular weight pectin;сarcinosarсoma Walker 256; synergy; potentiation.

Пектины – это широкий класс природных полисахаридов, обладающих полифункциональными свойствами. Важнейшими из них являются: высокая биодоступность, хорошая растворимость и низкая токсичность. Диапазон фармакологических эффектов нативных пектинов массой в сотни килодальтон в эксперименте весьма широк и охватывает практически все значимые направления лекарственной терапии [1, с. 297; 5, с. 674; 6, с. 247; 7, с. 336; 11, c. 295; 13, c. 546]. Пектины исследуются в качестве потенциальных модификаторов и противоопухолевых препаратов. Однако результаты этих исследований неоднозначны [4, c. 151; 8, c. 54; 9, c. 168; 10, c. 228; 14, c. 1854]. Если высокомолекулярные пектины в экспериментальной онкологии представлены достаточно широко, топрактически ничего не известно о модифицирующих свойствах и противоопухолевом потенциале у пектиновых производных массой менее 20 кДа. Кроме того, не освещены вопросы оценки характера фармакологического взаимодействия низкомолекулярного пектина и конвенциальных цитостатиков, хотя корректная оценка эффектов комбинированного воздействия представляет практический интерес.Одним из способов оценки взаимодействия является подход, основанный на теореме комбинаторного индекса, разработанной T. Chou и P. Talalay в 1980-х годах [12, c. 450].Практическое приложение детально разработанной и широко апробированной «универсальной» теории Chou-Talalay является одним из наиболее обоснованных подходов к оценке фармакодинамических взаимодействий лекарственных средств. Однако данный метод требует работы с различными дозами препаратов, что не всегда удобно в исследованиях invivo, а алгоритм расчетов предусматривает десяток этапов.

Эти неосвещенные аспекты определили актуальность данного исследования.

Результаты исследования и их обсуждение.

Исследования были реализованы на трансплантируемой крысиной карциносаркоме Уокера 256. Эксперименты на беспородных животных и крысах линии Вистар обоего пола проведены по общепринятым методикам согласно всем регламентирующим документам [5, c. 674]. При оценке противоопухолевого потенциала использовались общепринятые показатели оценки эффективности лечения: торможение роста опухоли (ТРО) и увеличения продолжительности жизни [5, c. 674; 11, c. 296]. Всего использовано 290 животных. Во всех скрининговых исследованиях водный раствор пектина в дозе 600 мг/кг и объеме 0,5 мл вводился зондом в желудок животного. Лечение начинали через 72 часа после перевивки опухоли и продолжали в течение 10–14 дней. Контрольные животные получали эквивалентное количество воды. Низкомолекулярный пектин M_w = 15 кДа был получен путем диспергирования в высокоэнергетической шаровой мельнице в течение 10 минут. Полученные результаты обработаны параметрическими и непараметрическими методами статистики [2; 3]. Достоверными считали результаты при уровне значимости p< 0,05.

С целью изучения модифицирующих свойств пектина были проведены исследования с комбинированным введением пектина в дозе 600 мг/кг и цитостатика – циклофосфана в дозе 25 мг/кг, вводимом внутрибрюшинно однократно на 5–6 день после перевивки опухоли.

В таблице 1 приведены средние размеры опухоли, начиная с 7-го дня наблюдения. Из этих данных видно, что терапия циклофосфаном не привела к радикальному результату, т. е. к исчезновению опухоли. Хотя торможение роста опухоли достигало статистически значимых величин, однако носило временный характер. Начиная с 14-го дня, темпы роста опухоли увеличились и к моменту окончания наблюдения средние размеры опухоли в этой группе практически сравнялись с контрольными значениями.

Таблица 1.

Динамика размеров опухоли Уокера в процессе лечения

В группе животных, получивших пектин, отмечалась иная картина. На 7-ой день средние размеры опухоли были меньше контрольных величин и меньше, чем в группе, получившей циклофосфан.В дальнейшем отмечался устойчивый рост опухоли лишь у части животных. К моменту окончания наблюдения размеры опухоли в этой группе были в 1,5 раза меньше контрольных величин и в 1,4 меньше, чем в группе «циклофосфан». А у 27,8 % животных опухоль регрессировала.

Параметры опухолевого роста в группе животных, получивших пектин и циклофосфан, кардинально отличались от остальных групп. На 7-ой день средние размеры опухоли у этих животных были наименьшими. Более того, по мере наблюдения размеры продолжали уменьшаться, и к 19-му дню наступила полная регрессия опухоли, т. е. наступило полное излечение подопытных животных.

Разумеется, что разный характер роста опухоли в этих группах отразился на продолжительности жизни животных (табл. 2).

Таблица 2.

Продолжительность жизни (дни)

Этот показатель был самым высоким у животных, получивших два препарата, достоверно отличаясь от такового в контрольной группе и группах, получивших пектин и циклофосфан в монорежиме. Животные, получившие только пектин и только циклофосфан, жили достоверно дольше, чем контрольные. Однако отличия между этими двумя группами по показателю продолжительности жизни носили случайный характер и достоверно не отличались. Хотя регрессии опухоли, как это было с изолированным применением пектина, в группе, получившей циклофосфан, не отмечено.

Поскольку животные, получавшие пектин в сочетании с циклофосфаном все выжили, а по правилам скрининга наблюдение за ними продолжается 90 дней, эта величина была принята в качестве средней продолжительности жизни данной группы. Таким образом, увеличение продолжительности жизни (рис. 1) в группе «пектин+циклофосфан» против группы «циклофосфан» составило 189,4 %, против контроля 373,7 % и против группы «пектин» 138,1 %.

Рисунок 1. Увеличение продолжительности жизни крыс с опухолью Уокера

На кинетических кривых (рис. 2) хорошо видно влияние каждого препарата и их совместного применения на опухолевый рост. График скорости роста в контрольной группе имеет вид S-образной кривой с периодами ускоренного роста в начальные и конечные сроки наблюдения. График кинетики роста опухоли в группе «циклофосфан» так же имеет классический вид. Начиная с 7-го по 12-ый день скорость роста убывает, затем сравнивается с контролем до 21-го дня. Позже скорость роста становится выше, чем в контроле.

В таблице 3 представлены данные по торможению роста опухоли в разных группах. Если при совместном применении двух препаратов этот показатель только нарастал, достигая максимума в 100 % к 19-му дню наблюдения, то в других группах он убывал. При этом в группе «циклофосфан» скорость убывания была выше, чем в группе «пектин.

Рисунок 2. Кинетика роста опухоли Уокера

Таким образом, данные таблиц 1, 3 и рисунка 2 свидетельствуют о том, что комбинация пектина и циклофосфана синергична, т. к. эффект усиления очевиден. Однако определить характер синергии по этим данным весьма сложно.

Классическое представление о варианте синергии – аддитивности гласит, что эффект от одновременного применения препаратов равен сумме эффектов каждого. При потенцировании эффект от одновременного применения должен быть больше, чем сумма эффектов каждого. Иначе говоря, о потенцировании можно говорить, если соблюдается условие: (ТРО_{пектин+циклофосфан}˃ ТРО_пектин + ТРО_{циклофосфан}), где ТРО – торможение роста опухоли. При аддитивном эффекте должно соблюдаться условие: (ТРО_{пектин+циклофосфан} = ТРО_пектин + ТРО_{циклофосфан}). Соблюдение условия: (ТРО_{пектин+циклофосфан}˂ ТРО_пектин + ТРО_{циклофосфан}) сидетельствует об антогонизме препаратов. Разумеется, основанием для утверждения о наличии эффекта потенцирования является предварительная проверка нулевой гипотезы. В качестве объектов сравнения были использованы значения ТРО_{пектин+циклофосфан} и ТРО_пектин + ТРО_{циклофосфан} на 19, 21, 25 и 28-ые дни наблюдения. В качестве критерия оценки уровня значимости использовался F-критерий Фишера с введением поправка Йейтсадля неравновеликих долей, когда Р˂25 %:

F=(ϕ₁- ϕ₂)²≥F_st, где ϕ = arcsin.

Таблица 3 .

Торможение роста опухоли Уокера при изолированном и комбинированном лечении пектином и циклофосфаном¹

¹- относительно размеров опухоли в контрольной группе

*** - р˂ 0,001; ** - р ˂ 0,01; * - р ˂ 0,05 (критерий Стьюдента-Фишера)

На рис. 3 представлена графическая оценка типа синергии при совместном применении пектина и циклофосфана. В качестве сравнения представлены данные аддитивного торможения роста опухоли при изолированном применении этих препаратов. Начиная с 19-го дня, разница в величине торможения роста опухоли между группами ТРО_{пектин+циклофосфан} и ТРО_пектин + ТРО_{циклофосфан} нарастает с 2,7 % до 57,1 % на 28-й день, хотя только с 21-го дня эта разница становится статистически достоверной (р˂0,01). Это значит, что с 21-го дня отмечается достоверный эффект потенцирования при совместном применении пектина и циклофосфана.

Рисунок 3. Потенцирование противоопухолевого эффекта при совместном применении пектина и циклофосфана

* - р˂ 0,01 (F – критерий Фишера)

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что совместное воздействие циклофосфана и пектина оказывает выраженное потенцирующее противоопухолевое действие на карциносаркому Уокера 256.

Интервально-кинетическая методика с использованием критерия Фишера позволяет наглядно оценить характер взаимодействия нескольких препаратов на моделях экспериментальных опухолей.

Список литературы:

1. Гурьев А.М. Химико-фармакологическое исследование полисахаридов высших растений и перспективы их использования в терапии злокачественных новообразований: Дисс. ... докт. фарм. наук. Пятигорск, 2011. – 297 с.
2. Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. – Л.: Медицина, 1978, 296 с.
3. Лакин Г.Ф. Биометрия: учеб.для вузов. – М.: Высшая школа, 1980. – 293 с.
4. Лопатина К.А. Водорастворимые полисахариды растений Сибири в комплексной терапии первиваемых опухолей: Дисс. … канд. мед.наук. – Томск, 2007. – 151 с.
5. Методические рекомендации по доклиническому изучению средств, обладающих способностью ингибировать процесс метастазирования и повышать эффективность цитостатической терапии опухолей // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. – М., 2005. С. 674–682.
6. Попов С.В. Иммуномодулирующее действие пектиновых полисахаридов: Дисс. … докт. биол. наук. Сыктывкар, 2010. – 247 с.
7. Разина Т.Г. Фитопрепараты и биологически активные вещества лекарственных растений в комплексной терапии злокачественных новообразований: экспериментальное исследование. Дисс. … докт. биол. наук, Томск, 2006. – 336 с.
8. Смирнов И.В., Бондарев А.А., Удут В.В., Каркищенко Н.Н. Фармакодинамические эффекты взаимного влияния веществ. // Биомедицина, 2011, № 1, С. 59–63.
9. Сафонова Е.А. Полисахариды растений, как корректоры цитостатической терапии экспериментальных опухолей: Дисс. … канд. мед. Наук. Томск, 2011. – 168 с.
10. Шилова Н.В. Влияние экстрактов ольхи клейкой на развитие перевиваемых опухолей в условиях цитостатической терапии. Дисс. … канд. мед. наук. Томск, 2004. – 228 с.
11. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США / Под ред. З.П. Софьиной, А. Голдина и др., – М.: Медицина, 1980, 295 с.
12. ChouT. C., Talalay P. Analysisofcombineddrugeffects: anewlookataveryoldproblem. Trends Pharmacol. Sci. 1983. – № 4. – Р. 450–454.
13. Hayashi A., Gillen A.C., Lott J.R. Effects of daily oral administration of quercetin chalcone and modified citrus pectin on implanted colon-25 tumor growth in Balb-c mice // Altern. Med. Rev., 2000. Vol. 5. P. 546–552.
14. Nangia-Makker P., Hogan V., Honjo Y. et. al. Inhibition of human cancer cell growth and metastasis in nude mice by oral intake of modified citrus pectin // J. Natl. Cancer Inst. 2002. Vol. 94. P. 1854–1862.