СЕЛЕКЦИЯ ДНК-АПТАМЕРОВ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ МЕТАЛЛО-БЕТА-ЛАКТАМАЗУ NEW DELHI

Козырь Арина Владимировна

канд. биол. наук, ст. науч. сотр., ФБУН ГНЦ ПМБ, г. Оболенск

E-mail: AVKozyr@gmail.com

Колесников Александр Владимирович

канд. биол. наук, вед. науч. сотр., ФБУН ГНЦ ПМБ, г. Оболенск

E-mail: pfu2000@mail.ru

Хлынцева Анна Евгеньевна

науч. сотр., ФБУН ГНЦ ПМБ, г. Оболенск

E-mail: 

Лунева Нина Михайловна

мл. науч. сотр., ФБУН ГНЦ ПМБ, г. Оболенск

E-mail: 

Красавцева Ольга Николаевна

науч. сотр., ФБУН ГНЦ ПМБ, г. Оболенск

Шемякин Игорь Георгиевич

д-р. биол. наук., проф., зам. Директора, ФБУН ГНЦ ПМБ, г Оболенск

E-mail: shemyakin@obolensk.org

Металло-бета-лактамаза New Delhi — фермент, обеспечивающий устойчивость бактерий к широкому спектру бета-лактамных антибио­тиков [7]. Они включают в себя антибиотики семейства карбапенемов, которые устойчивы к целому ряду бета-лактамаз и преимущественно используются при острых гнойных инфекциях, мультирезистентных нозокомиальных инфекциях, и также являются важнейшими антибио­тиками резерва. Ген металло-бета-лактамазы NDM-1 является членом большого семейства, кодирующего ряд гомологов, иначе называемых карбапенемазами. Инфекции, вызываемые патогенами, несущими металло-бета-лактамазу New Delhi, плохо поддаются терапии анти­биотиками. В частности, агентство по защите здоровья Великобрита­нии заявило, что большинство изолятов с ферментом NDM-1 устойчи­вы к стандартной антибиотикотерапии при тяжелых инфекциях [3].

Впервые лактамаза New Delhi была идентифицирована у пациен­та, госпитализированного в Нью-Дели (Индия) с инфекцией Klebsiella pneumonia [7]. Позднее лактамаза обнаруживалась при различных бактериальных инфекциях в Индии, Пакистане, Великобритании и США. Наиболее часто этот ген экспрессируют грамотрицательные бактерии Escherichia coli и Klebsiella pneumoniae, но ген NDM-1 спосо­бен распространяться от одной линии бактерий к другой путем горизонтального переноса [1], в частности, в составе эписомной ДНК, что не исключает возможность его появления и у штаммов возбудите­лей особо-опасных инфекций, например, у штамма Escherichia coli О157:H7.

Для раннего выявления возбудителей инфекционных заболева­ний несущих ген NDM-1, и контроля за распространением штаммов патогенных микроорганизмов секретирующих эту лактамазу, необхо­дима разработка высокочувствительных диагностических тест-систем, позволяющих быстро и эффективно провести определение металло-бета-лактамазы New Delhi в образцах окружающей среды, продуктов питания и биологических жидкостей человека и животных.

Одним из современных подходов к соданию диагностических тест-систем являются аптамерные технологии. Рынок диагностических аптамеров, составивший в 2009 году 26 млн. долларов, к 2014 году возрастет до 659 млн. долларов с ежегодным приростом до 124 % [4]. Хотя первые разработки в области аптамеров касались в основном терапевтических средств, в ближайшие годы прогнозируется, лидерст­во в создании диагностических аптамеров на основе ДНК. В России работы по созданию мишень-направленных аптамеров для диагности­ки бактериальных патогенов до настоящего времени не проводились.

В качестве диагностических молекул, аптамеры имеют ряд существенных преимуществ по сравнению с классической основой современных диагностикумов — антителами. При сходном или даже более высоком уровне специфичности они обладают не менее высокой аффинностью, однако, отбор аптамеров не требует продолжительных этапов подготовки антигена, иммунизации, получения гибридомных клонов. Степень разнообразия синтетических библиотек ДНК-апта­меров намного превышает таковую не только для первичного репертуара гибридомных клонов, но и уровень разнообразия, дости­гающийся при конструировании фаговых и рибосомных библиотек, таким образом, перспективы обнаружения высокоспецифичных апта­меров к целевой мишени весьма высоки [6]. Аптамеры намного дешев­ле в производстве, чем антитела, химический синтез аптамеров подразумевает простоту введения в них любых меток, и высокую сте­пень стандартизации производственных серий, недостижимую для биопрепаратов. Важным преимуществом использования аптамеров для разработки диагностикумов является, в первую очередь, высокая чувствительность детекции, достигающаяся, в частности, технологией иммуно-аптамерного ПЦР в режиме реального времени [2].

При отборе аптамеров применялась стратегия SELEX [5] с модификациями. Библиотека аптамеров была синтезирована в виде набора олигонуклеотидов, содержащих вырожденную последователь­ность длиной 40 нуклеотидов, фланкированную константными участками по 18 нуклеотидов, которые далее использовались в качестве зон отжига праймеров для ПЦР-амплификации. Поскольку одной из проблем отбора аптамеров является удаление последовательностей, неспецифически связывающихся с матрицами, на которых иммобилизован белок-мишень, в качестве мишени для селекции аптамеров к металло-бета-лактамазе New Delhi был получен химерный белок, продукт экспрессии рекомбинантного конструкта, включаю­щего фрагмент гена глютатион-S-трансферазы, химеризованный с последовательностью гена металло-бета-лактамазы New Delhi. Линкерная последовательность, соединяющая данные гены, представляла собой синтетический пептид, являющийся высокоспеци­фическим субстратом металло-протеазы летального фактора сибирской язвы (Рисунок 1).

Рисунок 1.Структура химерного рекомбинантного белка, примененного для отбора аптамеров, специфичных к металло-бета-лактамазе New Delhi.

Высокая аффинность глютатион-S-трансферазы к восстановлен­ному глютатиону позволяет специфически иммобилизовать белок-мишень на несущих глютатион парамагнитных частицах (Glutathione Magnetic Beads,Pierce), провести связывание аптамеров из синтети­ческой библиотки, отмывку частиц от несвязанных олигонуклеотидов и отрезание белка металло-бета-лактамазы New Delhi в растворе летальным фактором сибирской язвы, вместе со связавшимися с мишенью аптпмерами (Рисунок 2). Таким образом, можно выделить аптамерные последовательности, специфичные исключительно к металло-бета-лактамазе, поскольку элюция аптамеров происходит вместе с мишенью, без применения жёстких условий, обуславливаю­щих как специфическую диссоциацию аптамеров, так и элюцию моле­кул ДНК, связанных с иными по сравнению с мишенью компонентами твёрдой фазы.

Рисунок 2. Схема этапов отбора аптамеров, специфичных 
к металло-бета-лактамазе New Delhi, с использованием сконструированного химерного рекомбинантного белка. 
G — восстановленный глютатион, иммобилизованный
на парамагнитных частицах, RRKKVYPYPME — субстрат летального фактора сибирской язвы, GST - глютатион-S-трансфераза, ND — металло-бета-лактамаза New Delhi.

С использованием разработанной технологии отбора была прове­дена селекция аптамеров, специфичных к рекомбинантному белку NDM-1. Четыре раунда селекции, последующее клонирование отоб­ранных аптамерных последовательностей в плазмидный вектор (pBluescriptII SK-) и индивидуальный анализ полученных клонов при­вели к получению спектра аптамерных последовательностей, конс­танты связывания которых находились в диапазоне 10 ^-9—10 ^-10 М^-1.

Отобранные аптамеры были протестированы на способность детектировать присутствие NDM-1 с использованием ПЦР в режиме реального времени. Парамагнитные частицы с иммобилизованным глютатионом в течение часа инкубировались с растворами, содер­жащими различные концентрации химерного рекомбинантного белка, составлен­ного из фрагмента глютатион-S-трансферазы и металло-бета-лактамазы New Delhi. Было установлено, что наиболее эффективно связывающиеся аптамеры способны детектировать NDM-1 в кон­центрации до 1 пг/мл, что находится в области предела чувствитель­ности наиболее эффективных из современных широко употребимых диагностикумов. Результаты аптамерного ПЦР представлены на рисунке 3.

Рисунок 3. Результаты ПЦР-детекции металло-бета-лактамазы New Delhi специфическим ДНК-аптамером 
с использованием ПЦР в режиме реального времени. 
1—7 — различные концентрации металло-бета-лактамазы: 
1 — 100 нг/мл, 2 — 10 нг/мл, 3 — 1 нг/мл, 4 — 100 пг/мл,
5 — 10 пг/мл, 6 — 1 пг/мл, 7 — 0,1 пг/мл; 
8 — проба, не содержащая металло-бета-лактамазу New Delhi.

Разработанная оригинальная технология отбора аптамеров является достаточно универсальной и применима для высокоэффек­тивного отбора ДНК-аптамеров к различным белкам-мишеням. Скри­нинг библиотеки ДНК-аптамеров, связывающихся с NDM-1 позволил получить высокоаффинные молекулы, которые могут быть исполь­зованы для создания высокочувствительных диагностических тест-систем для нужд здравоохранения и контроля за качеством продуктов питания и микробиологическим состоянием окружающей среды.

Список литературы:

1. Fitter S., James R. Deconvolution of a complex target using DNA aptamers. // J. Biol. Chem. — 2005. — V. 280, № 40. — P. 34193—34201.
2. Irvine D., Tuerk C., Gold L. SELEXION. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment with integrated optimization by non-linear analysis. // J. Mol. Biol. — 1991. — V. 222, № 3. — P. 739—761.
3. Jackson J. W., Styrch U. Nucleic Acid Aptamers for Diagnostics and Therapeutics: Global Markets. [Электронный ресурс]: Сайт BCC Research Market Forecasting. URL: http://www.bccresearch.com/report/BIO071A.html# (дата обращения 24.03.2012)
4. National Resistance Alert 3 ADDENDUM. Carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in the UK: NDM (New Delhi Metallo-)b -lactamase: repeated importation from Indian subcontinent. [Электронный ресурс]: Официальный сайт Министерства Здравоохранения Великобритании. URL: http://www.hpa.org.uk/webc/HPAwebFile/HPAweb_C/1248854045473 (дата обращения 24.03.2012).
5. Poirel L., Schrenzel J., Cherkaoui A., Bernabeu S., Renzi G., Nordmann P. Molecular analysis of NDM-1-producing enterobacterial isolates from Geneva, Switzerland. // J. Antimicrob. Chemother. — 2011. — V. 66, № 8. — P. 1730—1733.
6. Yong D., Toleman M. A., Giske C. G., Cho H. S., Sundman K., Lee K., Walsh T. R. Characterization of a new metallo-beta-lactamase gene, bla (NDM-1), and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in Klebsiella pneumoniae sequence type 14 from India. // Antimicrob. Agents Chemother. — 2009. — Vol. 53, N 12. — P. 5046—5054.
7. Yoshida Y., Horii K., Sakai N., Masuda H., Furuichi M., Waga I. Antibody-specific aptamer-based PCR analysis for sensitive protein detection. // Anal. Bioanal. Chem. — 2009. — V. 395, № 4. — P. 1089—1096.