ИЗУЧЕНИЕ  ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОГО  И  НЕФРОПРОТЕКТОРНОГО  ДЕЙСТВИЯ  СУХОГО  ЭКСТРАКТА  ИЗ  ШЛЕМНИКА  БАЙКАЛЬСКОГО  И  ЕГО  КОМПЛЕКСА  ВКЛЮЧЕНИЯ  С  2-ГИДРОКСИПРОПИЛ-Β-ЦИКЛОДЕКСТРИНОМ

Доркина  Елена  Григорьевна

д-р  биол.  наук,  зав.  кафедрой  биохимии  и  микробиолоии  ПМФИ  —  филиала  ВолгГМУ,  г.  Пятигорск

E-mail:  elenadorkina@yandex.ru

Потапова  Анна  Александровна

аспирант  кафедры  биохимии  и  микробиологии  ПМФИ  —  филиала  ВолгГМУ,  г.  Пятигорск

Щербакова  Лариса  Ивановна

канд.  фарм.  наук,  доцент  кафедры  неорганической  химии  ПМФИ  —  филиала  ВолгГМУ,  г.  Пятигорск

Сергеева  Елена  Олеговна

канд.  фарм.  наук,  ст.  препод.  кафедры  биохимии  и  микробиологии  ПМФИ  —  филиала  ВолгГМУ,  г.  Пятигорск

Шлемник  байкальский  (Scutellaria  baicalensis  Georgi)  семейства  яснотковых  (Lamiaceae  Lindl.)  имеет  монголо-даурско-маньчжурский  тип  ареала.  В  качестве  сырья  для  медицинских  целей  используют  корни  шлемника  байкальского.  Общее  содержание  флавоноидных  соединений  в  корнях  составляет  более  10  %,  представленных  более  20  различными  флавоноидами.  Кроме  флавоноидных  соединений,  в  корнях  найдены  до  2,5  %  дубильных  веществ,  а  также  смолы,  эфирное  масло  [6,  С.  77—84].  Препараты  из  корней  шлемника  байкальского  широко  используются  в  странах  Азии  как  седативные,  антигипертензивные,  противовирусные  и  противовоспалительные  средства  [1,  С.  25—26].

Основным  препятствием  на  пути  эффективного  применения  флавоноидов  является  их  низкая  биодоступность,  обусловленная  их  низкой  растворимостью,  которая  не  позволяет  достигать  необходимого  уровня  всасывания  препаратов  из  кишечника  в  кровоток  и  в  достаточном  количестве  доставляться  к  органам-мишеням.  Повышение  биодоступности  флавоноидов  является  актуальной  задачей,  решение  которой  могло  бы  значительно  увеличить  их  терапевтическую  эффективность  и  расширить  сферу  медицинского  применения  [5,  С.  8—14].

В  качестве  соединений  улучшающих  растворимость  лекарственных  веществ  в  мировой  практике  используются  циклодекстрины  —  олигосахариды  с  гидрофильной  внешней  поверхностью.  Благодаря  такой  молекулярной  структуре,  циклодекстрины  обладают  уникальной  возможностью  действовать  как  наноконтейнеры  путем  включения  молекул  лекарственных  средств  в  свою  внутреннюю  полость  [5,  С.  8—14,  7,  С.  1—11].

Целью  нашего  исследования  явилось  установление  эффективной  дозы  и  сравнительное  изучение  защитного  действия  сухого  экстракта  (СЭ)  корней  шлемника  байкальского  и  его  комплекса  включения  с  2-гидроксипропил-β-циклодекстрином  (β-ГПЦД)  при  поражении  печени  и  почек.

Сухой  экстракт  из  корней  шлемника  байкальского  содержит  95  %  байкалина  (рисунок  1).

Рисунок  1.  Структурная  формула  байкалина

Для  приготовления  раствора  комплекса  включения,  сухой  экстракт  и  2-гидроксипропил-β-циклодекстрин  добавляли  исходя  из  необходимого  молярного  соотношения  компонентов  (1:3),  растворяли  в  воде  при  перемешивании  в  течение  30  минут,  затем  фильтровали.

Изучение  гепатопротекторного  и  нефропротекторного  действия  проведено  на  232  белых  беспородных  крысах-самках  с  исходной  массой  200—230  г,  находившихся  на  стационарном  режиме  вивария.  Поражение  почек  вызывали  путем  однократного  внутрибрюшинного  ведения  хлорида  ртути  (II).  СЭ  вводили  per  os  в  дозах  50,  100,  300,  500  мг/кг;  СЭ  +  ГПЦД  вводили  внутрибрюшинно  вначале  в  тех  же  дозах,  что  и  СЭ:  50,  100,  300,  500  мг/кг,  а  затем  —  в  дозах  5,  15,  25,  50  мг/кг  по  СЭ,  исходя  из  его  содержания  в  комплексе  включения  (60  %).  Исследуемые  вещества  вводили  за  1  час  до  введения  хлорида  ртути  (II)  и  затем  еще  в  течение  5  дней  (6  раз).  Модель  острого  CCl₄-гепатоза  воспроизводили  путем  введения  per  os  трехкратно  через  день  50  %  раствора  тетрахлорметана  в  дозе  0,3  мл  /  100  г  массы  тела.  СЭ  вводили  per  os  в  дозах  50,  100,  300,  500  мг/кг;  СЭ  +  ГПЦД  вводили  внутрибрюшинно  в  дозах  5,  15,  25,  50  мг/кг.  Вещества  вводили  за  7  дней  до  введения  CCl₄  и  затем  на  фоне  воспроизведения  модели.  В  качестве  патологического  контроля  служили  животные,  которые  вместо  исследуемых  субстанций  получали  эквиобъемное  количество  растворителя.  Забой  животных  проводили  путем  декапитации  под  лёгким  эфирным  наркозом  через  сутки  после  последнего  введения.  Здоровым  контролем  служили  интактные  животные.

Эффективность  действия  оценивали  по  степени  нормализации  биохимических  показателей  -  маркеров  поражения  печени  и  почек.  В  качестве  маркера  поражения  почек  использовали  клиренс  эндогенного  креатинина,  который  рассчитывали  исходя  из  концентрации  креатинина  в  крови,  в  моче,  объема  мочи  за  данное  время  и  время  сбора  мочи  [2,  С.  16—20,  4,  С.  24—26].

Для  оценки  эффективности  гепатозащитного  действия  определяли  активности  ферментов  в  сыворотке  крови:  аланинаминотрансферазы  (АлАт)  по  методу  Reitman  S.  и  Frankel  S.,  щелочной  фосфатазы  унифицированным  методом  по  «конечной  точке»,  содержание  общего  билирубина  (ОБ)  методом  Йендрашика  [3,  С.  110—121,  С.  249—251]  с  использованием  наборов  реактивов  «Ольвекс  Диагностикум».  Количество  триглицеридов  в  гомогенате  печени  (мкмоль/г)  измеряли  по  Gottfrieds  S.P.,  Rosenberg  B.  в  модификации  Сентебовой  [3,  С.  223—224].  Статистическую  обработку  результатов  проводили,  используя  t-критерий  Стьюдента.

Для  сравнения  гепатозащитного  и  нефрозащитного  действия  рассчитывали  коэффициенты  гепато-  и  нефропротекции  по  формуле: 

где:  Н  —  коэффициент  протекции; 

О  —  значение  показателя  в  опытных  группах; 

К  —  значение  показателя  у  животных,  получавших  только  токсикант; 

N  —  значение  показателя  у  интактных  животных.

В  результате  проведенных  исследований  установлено,  что  СЭ  при  поражении  почек  хлоридом  ртути  (II)  проявляет  нефропротекторное  действие,  которое  было  наиболее  выражено  в  дозе  300  мг/кг,  по  сравнению  с  дозами  50  и  100  мг/кг,  что  видно  из  данных,  представленных  в  таблице  1. 

Таблица  1.

Определение  эффективной  дозы  сухого  экстракта  из  шлемника  байкальского  при  поражении  почек  хлоридом  ртути  у  крыс

При  применении  СЭ  в  дозе  300  мг/кг  привело  к  достоверному  снижению  по  сравнению  с  контролем  содержания  креатинина  в  моче  на  41  %  ,  в  крови  —  на  82  %,  объем  мочи  при  этом  увеличился  на  379  %  и  достоверно  не  отличался  от  такового  у  интактных  крыс.  В  результате  клиренс  эндогенного  креатинина,  отражающий  скорость  клубочковой  фильтрации  и  очистительную  способность  почек,  был  увеличен  по  сравнению  с  нелеченными  животными  на  1594  %,  что  также  достоверно  не  отличалось  от  значения  данного  показателя  у  крыс  интактной  группы.

При  дальнейшем  увеличении  дозы  СЭ  до  500  мг/кг  клиренс  креатинина  несколько  уменьшился,  хотя  и  в  этом  случае  достоверно  не  отличался  от  здоровых  животных.  Содержание  креатинина  в  крови  снижалось  в  меньшей  степени  (–60  %)  и  объем  мочи  увеличивался  менее  выражено  (+  240  %). 

Таким  образом,  была  выявлена  наиболее  эффективная  доза  СЭ  при  пероральном  введении  на  модели  поражения  почек  хлоридом  ртути  (II),  которая  равнялась  300  мг/кг,  что  подтвердили  и  рассчитанные  коэффициенты  нефропротекции  (рисунок  2).

Рисунок  2.  Значения  коэффициента  нефропротекции  при  введении  различных  доз  сухого  экстракта  из  шлемника  байкальского

На  модели  поражения  печени  СС1₄  установлено,  что  СЭ  обладает  также  гепатозащитным  действием,  способствуя  нормализации  биохимических  маркеров.  Как  и  при  поражении  почек,  наиболее  эффективной  дозой  оказалась  доза  300  мг/кг.  При  этом  отмечалось  достоверное  по  сравнению  с  контролем  снижение  АлАт  на  42  %,  снижение  активности  ЩФ  на  69  %,  содержание  ОБ  на  48  %,  уровня  триглицеридов  в  печени  —  на  54  %,  что  было,  в  основном,  более  выражено,  как  по  сравнению  с  низкими  дозами,  так  и  по  сравнению  с  высокой  дозой  —  500  мг/кг  (таблица  2).  Это  четко  видно  и  по  коэффициенту  гепатопротекции  (рисунок  3).

Таблица  2.

Определение  эффективной  дозы  сухого  экстракта  из  шлемника  байкальского  при  поражении  печени  СС1₄  у  крыс

Рисунок  3.  Значения  коэффициента  гепатопротекции  при  введении  различных  доз  сухого  экстракта  из  шлемника  байкальского

При  изучении  нефропротекторного  действия  комплекса  включения  СЭ+  β-ГПЦД  в  дозах  50  и  100  мг/кг  гибель  животных  в  ходе  эксперимента  составила  4  из  8-ми  и  5  из  8-ми  животных  соответственно,  т.  е.  в  последнем  случае  такая  же,  как  и  в  контрольной  группе  (таблица  3).  В  группах,  получавших  изучаемый  комплекс  включения  в  дозах  300  и  500  мг/кг,  погибли  все  животные. 

Таблица  3.

Гибель  животных  на  модели  поражения  почек  хлоридом  ртути  при  лечебном  введении  комплекса  включения  сухого  экстракта  из  шлемника  байкальского  и  β-ГПЦД  в  дозах  50—500  мг/кг

Таблица  4.

Гибель  животных  при  введении  комплекса  включения  сухого  экстракта  из  шлемника  байкальского  и  β-ГПЦД  в  дозах  50—500  мг/кг

Гибель  животных  отмечалась  при  введении  комплекса  включения  СЭ+β-ГПЦД  в  дозах  50,  100,  300,  500  мг/кг  и  без  токсиканта,  вызывающего  поражение  почек,  но  в  группе,  получавшей  только  β-ГПЦД,  все  животные  остались  живы  (таблица  4).  Полученные  данные  указывали  на  необходимость  снижения  дозы  СЭ  при  его  внутрибрюшинном  введении  в  виде  комплекса  с  β-ГПЦД.

В  дальнейшем  изучение  нефро-и  гепатопротекторного  действия  комплекса  включения  СЭ  +  β-ГПЦД  было  проведено  в  дозах  на  порядок  ниже  тех,  которые  использовались  при  пероральном  введении  только  СЭ,  а  именно  —  5,  15  и  25  мг/кг.

Таблица  5.

Определение  эффективной  дозы  комплекса  включения  сухого  экстракта  из  шлемника  байкальского  и  β-ГПЦД  при  поражении  почек  хлоридом  ртути  у  крыс

Как  видно  из  таблицы  5,  наибольший  эффект  на  модели  поражения  почек  хлоридом  ртути  наблюдался  при  применении  СЭ  +  β-ГПЦД  в  дозе  15  мг/кг,  когда  в  наибольшей  степени  повышался  по  сравнению  с  контрольной  группой  животных  клиренс  креатинина  (+1574  %),  достигая  интактного  уровня.  При  повышении  дозы  до  25  мг/кг  клиренс  креатинина  достоверно  не  отличался  от  группы  патологического  контроля.  Коэффициент  нефропротекции  также  был  наибольшим  при  применении  СЭ  +  β-ГПЦД  в  дозе  15  мг/кг  (рисунок  4).

Рисунок  4.  Значения  коэффициента  нефропротекции  при  введении  различных  доз  комплекса  включения  СЭ+  β-ГПЦД

При  изучении  гепатозащитного  действия  СЭ  +  β-ГПЦД  в  дозах  5,  15  и  25  мг/кг  наибольшая  нормализация  изученных  биохимических,  определяемых  в  качестве  маркеров  поражения  печени,  также  отмечалась  в  случае  введения  комплекса  включения  в  дозе  15  мг/кг,  а  именно  достоверное  снижение  содержания  триглицеридов  в  печени  на  54  %,  активности  АлАт,  ЩФ  и  содержания  ОБ  в  сыворотке  крови  —  на  27,  46  и  49  %  соответственно  (таблица  6).  При  повышении  дозы  до  25  мг/кг  эти  показатели  уменьшались  в  меньшей  степени  —  на  46  %,  27  %,  39  %  и  46  %  соответственно.  При  введении  СЭ  +  β-ГПЦД  в  дозе  5  мг/кг  содержание  билирубина  в  крови  достоверно  не  отличалось  от  патологического  контроля,  а  содержание  триглицеридов  в  печени  и  активности  АлАт  и  ЩФ  снижались  лишь  на  34  %,  22  %  и  39  %  соответственно.  Коэффициент  гепатопротекции  оказался  наиболее  высоким  у  животных,  получавших  СЭ  +  β-ГПЦД  в  дозе  15  мг/кг  (рисунок  5).

Таким  образом,  эффективная  доза  СЭ  +  β-ГПЦД  как  при  испытании  данного  комплекса  включения  в  качестве  нефропротектора,  так  и  гепатопротектора  оказалась  равной  15  мг/кг,  т.  е.  значительно  ниже,  чем  при  пероральном  применении  в  аналогичных  опытах  по  изучению  СЭ,  когда  его  эффективная  доза  составляла  300  мг/кг.

Таблица  6.

Определение  эффективной  дозы  комплекса  включения  сухого  экстракта  из  шлемника  байкальского  и  β-ГПЦД  при  поражении  печени  СС1₄  у  крыс

Рисунок  5.  Значения  коэффициента  гепатопротекции  при  введении  различных  доз  комплекса  включения  СЭ  +  β-ГПЦД

Итак,  проведенные  исследования  показали,  что  СЭ,  содержащий  байкалин,  обладает  гепато-  и  нефропротекторным  действием  при  пероральном  применении  и  при  внутрибрюшинном  введении  в  виде  комплекса  с  β-ГПЦД.  Эффективные  дозы  составили  300  и  15  мг/кг  соответственно,  как  при  патологии  печени,  так  и  при  патологии  почек.  Полученные  результаты  свидетельствуют  о  перспективе  создания  различных  форм  лекарственных  препаратов  из  шлемника  байкальского,  обладающих  комплексным  действием  и  одновременно  защищающих  печень  и  почки,  поскольку  их  тесная  функциональная  и  анатомическая  связь  часто  обуславливает  их  сочетанное  повреждение,  что  наблюдается  при  использовании  НПВС,  антибиотиков,  цитостатиков  и  др.  Применение  сухого  экстракта  в  виде  комплекса  позволяет  значительно  снизить  дозу  препарата. 

Список  литературы:

1.Ажунова  Т.А.  Фитофармакокоррекция  лекарственных  гепатопатий  //  Практическая  фитотерапия.  —  2004.  —  №  3.  —  С.  25—26.

2.Арутюнов  Г.П.,  Оганезова  Л.Г.,  Соколова  А.В.  Оценка  почечной  функции,  степени  поражения  клубочкового  аппарата  и  тубулоинтерстициальной  ткани  почек  //  Клиническая  нефрология.  —  2011.  —  №  6.  —  С.  16—20.

3.Колб  В.Г.,  Камышников  В.С.  Справочник  по  клинической  химии.  Минск,  1982.  —  368  с.

4.Кучук  Э.Н.,  Висмонт  Ф.И.  Патологическая  физиология  почек.  Минск,  2011.  —  41  с.

5.Морина  Е.А.,  Сульянов  С.Н.,  Фельдман  Н.Б.  Получение  наночастиц  растительных  биофлавоноидов  рутина,  кверцетина  и  силимарина  //  Вопросы  биологической,  медицинской  и  фармацевтической  химии.  —  2011.  —  №  7.  —  С.  8—14.

6.Химический  состав  шлемника  байкальского  /  Д.Н.  Оленников  [и  др.]  //  Химия  растительного  сырья.  —  2010.  —  №  2.  —  С.  77—84.

7.Loftsson  T.,  Duchene  D.  Cyclodextrins  and  their  pharmaceutical  applications.  //Int.  J.  of  Pharm.  —  2007.  —  №  329.  —  P.  1—11.