ИЗУЧЕНИЕ  АДГЕЗИВНОЙ  СПОСОБНОСТИ  LISTERIA  MONOCYTOGENES  К  ЭРИТРОЦИТАМ  ЧЕЛОВЕКА  И  БАРАНА

Серегина  Наталья  Владимировна

канд.  биол.  наук  ,доцент  медицинского  института  Тульского  Государственного  Университета,  РФ,  г.  Тула

E-mail:  seregina.79@mail.ru

Саломатина  Татьяна  Владимировна

студент  медицинского  института  Тульского  ГосударственногоУниверситета,  РФ,  г.  Тула

E-mail: 

STUDY  OF  ADHESIVE  ABILITY  LISTERIA  MONOCYTOGENES  TO  HUMAN  ERYTHROCYTES  AND  SHEEP

Seregina  Natalia  Vladimirovna

candidate  of  Biological  Science,  accociate  professor  of  the  medical  Institute  Tula  State  University,  Russia  Tula

Salomatina  Tatyana  Vladimirovna

Medical  Institute  student  of  the  Tula  State  University,  Russia  Tula

АННОТАЦИЯ

Изучено  влияние  биологически  активных  веществ,  входящих  в  состав  ацетоновой  и  этанольной  вытяжек  шунгитовой  породы  на  адгезивную  способность  Listeria  monocytogenes.  Доказано  уменьшение  бактериальной  адгезии  под  влиянием  биологически-активных  веществ,  идентифицированных  в  растворах  вытяжек.

ABSTRACT

The  influence  of  biologically  active  substances  included  in  the  aceton  and  ethanol  extracts  of  shungite  rock  on  adhesion  ability  Listeria  monocytogenes.  Proven  reduction  of  bacterial  adhesion  under  the  influence  of  biologically  active  substances,  identified  in  solutions  extracts.

Ключевые  слова:  адгезия;  Listeria  monocytogenes;  экстракты  шунгита.

Keywords:  adhesion;  Listeria  monocytogenes;  extracts  of  shungite.

Установление  взаимоотношений  между  бактериальным  патогеном  и  эукариотической  клеткой  при  формировании  межклеточных  контактов  на  ранних  этапах  инфекционного  процесса  рассматривается  нами  как  наиболее  важное  звено  в  ходе  патогенетических  событий  и  определяет  дальнейшее  течение  заболевания.  Именно  на  этой  стадии  растворы  биологически  активных  составляющих  шунгитовой  породы  активно  действуют  на  условно-патогенные  бактерии  рода  Listeria  monocytogenes.  Изучение  механизмов,  обеспечивающих  прикрепление  (адгезию)  бактерий  к  клеткам-мишеням,  является  эффективной  предпосылкой  создания  профилактических  антиадгезивных  препаратов  на  основе  шунгита,  направленных  на  снижение  или  предотвращение  колонизации  тканей  хозяина.  Микробиологи  активно  изучают  влияние  природных  биополимеров,  органических  и  неорганических  веществ,  на  адгезию  бактерий  [1,  c.  34—39].

Известно,  что  для  подавления  бактериальной  адгезии  применяются  два  разных  подхода.  Первый  связан  с  блокированием  лигандов  бактерий,  второй  —  с  блокированием  рецепторов  клеток  хозяина.  Предотвращение  или  снижение  адгезии  с  помощью  конкурентного  ингибирования  веществами,  содержащими  структурные  аналоги  адгезинов  или  клеточных  рецепторов,  является  перспективным  направлением  в  системе  профилактики  инфекционных  заболеваний.

Цель:  Изучить  влияние  веществ,  входящих  в  состав  вытяжек,  полученных  из  шунгитовой  породы,  на  адгезивную  способность  условно-патогенных  бактерий.

Методы:  в  качестве  тест-объектов  взяты:  музейный  штамм  Listeria  monocytogenes  I  серогруппы  ATCC  54180  и  24  клинических  штамма,  выделенных  от  больных  с  гнойно-воспалительными  заболеваниями. 

Испытуемые  бактерии  обрабатывались  ацетоновым  и  этанольным  экстрактами  органического  вещества  шунгитовой  породы.  Вытяжки  были  получены  последовательной  экстракцией  обогащенной  шунгитовой  породы  органическими  растворителями  с  постепенно  возрастающей  полярностью  [7,  c.  1—34].  Работа  по  изучению  влияния  растворов  вытяжек  шунгита  на  вирулентные  свойства  бактерий  выполнена  на  базе  Городской  централизованной  диагностической  бактериологической  лаборатории  (ГЦДБЛ)  при  ГУЗ  Городская  больница  №  1  города  Тулы  и  кафедре  санитарно-гигиенических  и  профилактических  дисциплин  медицинского  института  Тульского  государственного  университета.  В  работе  использовалась  клинические  методы  исследования,  включающие  микроскопические,  бактериологические,  статистические  методы.  Для  изучения  адгезивного  процесса  микроорганизмов  нами  были  использованы  методические  рекомендации  [4,  5,  6],  а  также  доступная  и  информативная  методика  В.И.  Брилиса,  Т.А.  Брилене,  Х.П.  Ленцнера  [2,  c.  210—212].  Эритроциты  можно  получить  в  необходимых  количествах,  к  тому  же  они  имеют  на  своей  поверхности  гликофорин  —  вещество,  идентичное  гликокаликсу  эпителиальных  клеток,  на  котором  расположены  рецепторы  для  адгезинов  микробов.  Эритроциты  могут  быть  универсальной  моделью  для  изучения  адгезии.  Схема  исследования  адгезивности  бактерий  включала  два  метода.  Экспресс-метод  предназначен  для  быстрого  и  одновременного  определения  адгезивных  свойств  большого  числа  штаммов  бактерий.  Это  качественный  метод.  Развернутый  предназначен  для  количественной  оценки  адгезивных  свойств  с  помощью  следующих  показателей:

·        СПА  (средний  показатель  адгезии).  Под  ним  понимается  среднее  количество  микробов,  прикрепившихся  к  1  эритроциту  при  подсчете  не  менее  25  эритроцитов,  учитывая  не  более  5  эритроцитов  в  одном  поле  зрения.  Интерпретация  СПА  представлена  в  табл.  1.

Таблица  1.

Интерпретация  среднего  показателя  адгезии

·        К  (коэффициент  участия  эритроцитов  в  адгезивном  процессе).  Это  процент  эритроцитов,  имеющих  на  своей  поверхности  адгезированные  микробы.

·        ИАМ  (индекс  адгезивности  микроорганизма).  Это  среднее  количество  микробных  клеток  на  одном  участвующем  в  адгезивном  процессе  эритроците,  исчисляется  по  формуле:

·         

Микроорганизм  считают  неадгезивным  при  ИАМ1,75;

низкоадгезивным  —  от  1,76  до  2,5;среднеадгезивным  —  от  2,51  до  4,0; 

высокоадгезивным  при  ИАМ  выше  4,0. 

Для  чистоты  эксперимента  клеточным  субстратом  служили  нативные  эритроциты  человека  O  (I)  Rh  (+)  группы  крови  и  эритроциты  барана,  так  как  учитавалась  различная  способность  бактерий  к  адгезии.  Кровь  брали  от  здорового  барана  в  возрасте  не  менее  1—5  лет  в  стерильный  флакон  с  бусами  и  встряхивали  в  течение  10—15  минут  для  отделения  фибрина,  удаляли  сыворотку,  эритроцитарную  массу  центрифугировали  со  скоростью  1000  об/мин.,  эритроциты  отмывали  физиологическим  раствором  для  получения  прозрачного  надосадка.  У  человека  брали  кровь  в  день  постановки  реакции.

Listeria  monocytogenes  выращивали  на  5  %  кровяном  агаре  и  хромогенном  селективном  агаре  по  Оттавиани-Агости  (Chromocult  Listeria  Selective  Agar,  base  acc.  Ottaviani  and  Agosti)  [8,  c.  74—85].  Время  инкубации  составляло  18—24  часа,  при  температуре  37  ⁰С.  Строго  соблюдали  температурный  режим,  так  как  при  понижении  температуры  инкубации  синтез  адгезинов  подавляется.  Поскольку  Listeria  monocytogenes  является  психрофильным  микробом,  после  инкубации  и  роста  на  кровяном  и  хромогенном  агаре  в  термостате,  чашки  с  посевами  помещались  в  холодильник,  так  как  температура  6—8  ⁰С  усиливает  адгезивные  свойства  листерий,  что  способствует  более  активному  связыванию  с  эритроцитами  человека  и  барана  [3,  c.  20—23].

С  помощью  прибора  денситометра  (ATB  Densitometer)  фирмы  Bio  Merieux  (Франция),  готовили  взвесь  эритроцитов  в  физиологическом  растворе  10⁸  клеток/мл  0,5  MF  и  взвеси  бактерий  10⁹клеток/мл4  MF.  Прибор  позволяет  автоматически  установить  оптический  стандарт  мутности  по  шкале  Mac  Farland,  определить  концентрацию  бактериальных  взвесей  табл.  2. 

Таблица  2.

Интерпретация  эквивалентов  стандартов  Мак  Фарланда  (MF)

Взвесь  бактериальных  культур,  1  мкл  Д-маннозы,  эритроциты  барана  или  человека  по  капле  наносили  на  обезжиренное  предметное  стекло,  смешивали,  инкубировали  при  температуре  37  ⁰С  в  течение  30  минут.  Готовые  мазки  высушивали  при  комнатной  температуре,  фиксировали  в  96  ⁰этиловом  спирте  и  окрашивали  по  Граму  и  Романовскому-Гимзе.  Изучение  адгезии  вели  при  помощи  светового  микроскопа  CETI.  Для  того,  чтобы  изображение  было  полностью  и  в  точности  передано  на  экран  компьютера  применяли  цифровую  камеру-окуляр  для  микроскопа  (модель  ДСМ  3  МПикс.,  USB  2.0.)  фирмы  «Shangrao  Tele  View  Optical  Instruments  Co.,  Ltd.

Результаты:  количественные  характеристики  изучения  адгезивных  свойств  бактерий  представлены  в  табл.  3.

Таблица  3.

Результаты  изучения  адгезивной  активности  бактерий,  под  воздействием  растворов  вытяжек  шунгитовой  породы  (клеточный  субстрат  —  эритроциты  барана)

Таблица  4.

Клеточный  субстрат  —  эритроциты  человека  О  (I)  Rh  (+)

Выводы:  Анализ  приведенных  данных  показавает,  что  контрольные  штаммы  Listeria  monocytogenes  до  обработки  1  %  и  3  %  ацетоновой  и  этанольной  вытяжкой  имеют  средний  показатель  адгезии  (СПА<4).  Принимая  во  внимание  другой  количественный  показатель  —  индекс  адгезивности  (ИАМ),  можно  сделать  вывод  о  том,  что  до  обработки  1  %  и  3  %  ацетоновой  и  этанольной  вытяжкой  все  контрольные  бактерии  считались  высокоадгезивными.  По  нашему  мнению,  это  обусловлено  тем,  что  листерия  имеет  нефимбриальные  адгезины.  С  помощью  адгезинов  бактерии  осуществляют  выбор  субстрата,  чувствительного  к  дальнейшему  поражению  токсином  или  ферментами.  Эксперимент  демонстрирует  уменьшение  значений  СПА,  КУЭ,  ИАМ  у  всех  видов  испытуемых  бактерий,  при  воздействии  растворов  вытяжек. 

Изучение  механизмов,  обеспечивающих  прикрепление  (адгезию)  бактерий  к  клеткам-мишеням,  является  эффективной  предпосылкой  для  создания  профилактических  антиадгезивных  препаратов  на  основе  шунгита,  направленных  на  снижение  или  предотвращение  колонизации  тканей  хозяина  и  получения  высокоэффективных  антибактериальных  препаратов  типа  антисептиков.

Список  литературы:

1.Бондаренко  В.М.  Факторы  патогенности  бактерий  и  их  роль  в  развитии  инфекционного  процесса.  //  ЖМЭИ.  —  1999.  —  №  5.  —  С.  34—39. 

2.Брилис  В.И.,  Брилене  Т.А.,  Ленцнер  Х.П.  и  др.  Методика  изучения  адгезивного  процесса  микроорганизмов.  //  Лабораторное  дело.  —  1986.  —  №  4.  —  С.  210—212.

3.Зайцева  Е.А.,  Сомов  Г.П.  Влияние  температуры  на  адгезивные  свойства  листерий.  //  ЖМЭИ.  —  2006.  —  №  3.  —  С.  20—23.

4.Методические  рекомендации  №  28-6/7  «Выявление  гемолитических,  адгезивных  и  энтеротоксигенных  свойств  энтеробактерий».  М.,  1987.

5.Методические  рекомендации  к  контролю  питательных  сред  по  биологическим  показателям.  М.,1980.

6.Методические  рекомендации  к  контролю  питательных  сред  по  биологическим  показателям  и  ведению  тест-культур  при  работе  бактериологических  лабораторий.  Тула,  2000.

7.Прокопченков  Д.В.  Системный  анализ  биологической  активности  шунгитовой  породы  на  основе  ее  вещественного  состава.  Автореферат  дисс.  канд.  биол.  наук,  Тула,  2008.

8.Честнова  Т.В.,  Григорьев  Ю.И.  Современные  проблемы  листериоза:  распространенность,  эпидемиология,  бактериологическая  диагностика.  Изд-во  Тул  ГУ,  2002.  —  85  с.