ВОЗМОЖНОСТИ ВОССТАНОВЛЕНИЯ АНТИМИКРОБНЫХ СВОЙСТВ АНТИБИОТИКОВ ПРОТИВ РЕЗИСТЕНТНЫХ ШТАММОВ

Способность наночастиц металлов, органических соединений проявлять неклассические свойства в отличие от тех же веществ, представленных в микромире, широко используется в разных сферах деятельности: промышленности, медицине, фармацевтике и пр. Известны уникальные свойства наночастиц металлов и нанокомпозитов на их основе, проявляющих бактерицидные свойства. В этой сфере введутся активные исследования. Но при этом не уделяется внимание класси­ческим антибиотикам. В процессе изучения данного вопроса были найдены только лишь пара исследований, принадлежащих одному научному коллективу, который поставил перед собой задачу проанализировать изменение свойств антибиотиков, обработанных ультразвуком высокой частоты в разных атмосферах.

Метод ультразвуковой обработки уникален, поскольку позволяет получать материалы с заданными свойствами за довольно короткий срок [1]. Кроме того, данный метод довольно дешев и не требует использования специальных растворителей и других веществ, а также позволяет минимизировать количество операций в процессе обработки. Таким образом, изменяя только лишь время обработки частиц, возможно изменять их физико-химические, морфологические и иные свойства.

В данной работе исследовались частицы антибиотиков тетра­циклина и хлорамфеникола на устойчивых к данным антибиотикам штаммах E.coli Nova Blue с хромосомной кассетой устойчивости к тетрациклину и E.coli 75-3 c кассетой устойчивости к хлорамфениколу в умеренном фаге Р1, оптимальной концентрацией антибиотиков для данных штаммов – 12,5 мкг/мл.

Наноструктурированные частицы антибиотиков были получены по схеме, предложенной авторами Геданкин и др [2]. Для эксперимента готовились растворы антибиотиков концентрацией 1 мг/мл. И обраба­тывались на сонификаторе UIP 1000 hd (Hielscher, Германия) при 20 кГц (амплитуда 20 мм) в течение 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3,0; 5,0; 7,5; 10 минут. После окончания сонификации образцы помещались в микроцентри­фужные пробирки и центрифугировались при 14000 об/мин при температуре плюс 4°С в течение 30 минут для отделения более крупной фазы частиц от более мелкой. Для последующих исследований готовились новые растворы антибиотиков.

Антимикробную активность исследуемых антибиотиков определяли методом диффузии в агар и инкубированием бактериальных культур с частицами антибиотиков в жидкой питательной среде в течение 16‑18 часов. В результате исследования антимикробной активности на плотные питательные среды наносили газон стандартизированных ночных культур, после подсушивания поверх газона наносили растворы антибиотиков (надосадочную жидкость после центрифугирования) в количестве 3 мкл.

Для определения антимикробной активности в жидких средах стандартизированную ночную культуру (до 10⁶ кл/мл) в количестве 200 мкл помещали в микроцентрифужные пробирки к ним добавляли растворы частиц в количестве 1,25% и 12,5% по объему и доводили объем до 400 мкл.

Реальную концентрацию частиц, используемых в анализе, опре­деляли на ПЭ-3000 УФ спектрофотометре при длине волны 277 нм (тетрациклин) и 278 нм (хлорамфеникол). Динамику изменения размеров и форм частиц наблюдали, снимая данные при помощи SEM.

В результате исследований стало понятно, что частицы антибиотиков, обработанных ультразвуком в течение определенного времени, имеют непрямую зависимость от времени обработки.

Рисунок 1. Антимикробная активность (А) – тетрациклина в отношении E.coli Nova Blue, (Б) – хлорамфеникола в отношении E.coli 75-3

На рисунке 1 видно, что частицы, обработанные ультразвуком, проявляют активность в отношении устойчивых штаммов. При этом наименьший диаметр зоны ингибирования имеет образец № 9 – анти­биотик, не обработанный УЗ.

Для понимания динамики изменения активности наноструктури­рованных частиц антибиотиков в отношении устойчивых штаммов, дополнительно проводили исследование в жидкой питательной среде.

Рисунок 2. Зависимость антимикробных свойств тетрациклина от концентрации исходных растворов обработанных частиц

На диаграмме видно, что УЗ-обработка частиц тетрациклина приводит к изменению и усилению антимикробных свойств частиц. При этом не наблюдается прямолинейная зависимость антимикробной активности от времени обработки частиц.

Интересно отметить, что концентрация частиц также циклическим образом меняется от времени обработки частиц. Так, началом моди­фикации частиц тетрациклина можно считать 1,5 минуты обработки. Здесь несмотря на снижение концентрации антибиотика, увеличивается антимикробная его активность. Таким образом, возможно, в данной точке происходит образование более мелких частиц антибиотика. Таким образом, можно предположить, что более мелкие частицы проникают внутрь клетки и блокируют синтез белка. Далее с течением времени обработки концентрация антибиотика увеличивается, но сни­жается его активность (4 образец). Наилучшие антимикробные свойства проявляют образцы 6 и 7.

Концентрация частиц в исходном растворе у них примерно равна концентрации частиц образца № 5. Но при этом заметно увеличивается уровень ингибирования.

Таким образом, можно предположить, что модификация анти­биотика тетрациклина начинается примерно на 1,5 мин обработки. Но наиболее активными антибактериальными свойствами обладает образец, обработанный ультразвуком в течение 5,0 минут.

Рисунок 3. Зависимость антимикробных свойств хлорамфеникола от концентрации исходных растворов обработанных частиц

На диаграмме также видно, что антимикробные свойства частиц хлорамфеникола меняются циклично. Нет явной прямолинейной зависимости. Так, наилучшими антимикробными свойствами обладают частицы, обработанные в течение 2,0 минут. При дальнейшей ультра­звуковой обработке антимикробные свойства частиц хлорамфеникола становятся ниже, возможно это связано с увеличением размеров конгломератов антибиотика при более длительном времени обработки. Здесь же показано, что независимо от концентрации поученных частиц антибиотика его антимикробные свойства изменяются.

Таким образом, можно заключить, что в результате сонохими­ческой обработки эффективность антибиотиков против резистентных к ним штаммов повышается, что может иметь существенное значение для терапии заболеваний, обусловленных этими штаммами.

Список литературы:

1. Jana Dulle,a Silke Nemeth,a Ekaterina V. Skorbb and Daria V. Andreeva. Sononanostructuring of zinc-based materials. RSC Advances. Received 18th September 2012, Accepted 15th October 2012, DOI: 10.1039/c2ra22200k.
2. Ulyana Shimanovich, Anat Lipovsky, Dror Eliaz, Sally Zigdon, Tuomas P.J. Knowles, Yeshayahu Nitzan , Shulamit Michaeli , and Aharon Gedanken. Tetracycline Nanoparticles as Antibacterial and Gene-Silencing Agents. www.advhealthmat.de.