ОТРАБОТКА МЕТОДИКИ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ИЗ КОСТНОГО МОЗГА КРЫС

PROCESSING OF THE METHOD OF OBTAINING CYTOGENETIC PREPARATIONS FROM THE RATS BONE MARROW

Elena Trubnikova

doc. biologist. Sciences, Head. Research Laboratory "Genetics" Kursk State University,

Russia, Kursk

Marina Radionova

Candidate of Science,, lecturer of the Kursk State Agricultural Academy, research fellow of the research laboratory "Genetics"

Kursk State University,

Russia, Kursk

Artem Spashko

3rd year student of the Faculty of Veterinary Medicine, Kursk State Agricultural Academy,

Russia, Kursk

Sandro Sopromadze

1-уеаr student, Kursk State Medical University,

Russia, Kursk

АННОТАЦИЯ

В статье изложена рабочая методика приготовления цитогене­тических препаратов хромосом из костного мозга лабораторных животных (крыс). Цель – отработать методику приготовления цитогенетических препаратов хромосом из костного мозга крыс. Вывод: проведена серия опытов с различными методологиями и подобраны оптимальные условия для получения цитогенетических препаратов метафазных хромосом из костного мозга крыс.

ABSTRACT

The technique of chromosomes preparation from the bone marrow of laboratory animals (rats) is shown in the article. The goal is to work out a technique for preparing cytogenetic preparations of chromosomes from bone marrow of rats. Conclusion: a series of experiments with various methodologies was conducted and optimal conditions were selected for obtaining cytogenetic preparations of metaphase chromosomes from bone marrow of rats.

Ключевые слова: цитогенетические препараты, костный мозг, крысы.

Keywords: cytogenetic preparations, bone marrow, rats.

В настоящее время создается очень много лекарственных средств. Процесс создания лекарств очень долгий и трудоёмкий. В любом случае все они должны пройти доклинические испытания на различных лабораторных животных, в том числе и грызунах. Одно из таких испытаний – анализ мутагенной активности на хромосомах крыс. В этой связи была выбрана цель нашего исследования – отработать методику получения цитогенетических препаратов из костного мозга крыс.

Существует несколько канонических этапов получения цитогене­тических препаратов хромосом животных, в том числе и человека (Медведев Н.Н., 1968; Захаров А.Ф., 1982):

1. использование колхицина (колцемида) – ингибитора образования митотического веретена, который останавливает деление клетки на стадии метафазы;
2. гипотонический шок с использованием растворов солей калия или натрия, которые вследствие разницы осмотического давления внутри и снаружи клеток вызывают их набухание и разрыв межхромосомных связей. Такая процедура приводит к отделению хромосом друг от друга, способствуя более сильному их разбросу в метафазных пластинках;
3. фиксация клеток с использованием этанола (метанола) и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1 (фиксатор Карнуа), что способ­ствует сохранению структуры хромосом;
4. раскапывание суспензии клеток на предметные стекла;
5. окрашивание хромосомных препаратов.

В любом случае необходима адаптация общеизвестных методик под частные условия лаборатории («подгонка» под реактивы и оборудование, а также лабораторные навыки исследователя) [5].

После серии экспериментов наибольшее количество метафазных пластинок было получено при использовании нижеприведённой рабочей схемы.

Материалом послужил костный мозг, полученный из бедренных, большеберцовых костей и локтевых костей экспериментальных животных (крыс линии Wister), который вымывали небольшим количеством физраствора и помещали в стерильные флаконы, после чего доставляли в генетическую лабораторию. Препараты хромосом получали прямым методом без культивирования [2]. Сама процедура приготовления цитогенетических препаратов проводилась в специальном боксовом помещении по следующей рабочей схеме.

Костный мозг отмывали сменой физраствора NaCl после центри­фугирования и ресуспендирования дважды, доводя объем в каждом случае до 10 мл, выдерживая в термостате при температуре 37 ℃ по полтора часа. Перед второй отмывкой добавляли колхицин в конечной концентрации 0,5 мкл/мл. Затем центрифугировали в течение 10 минут на 1000 оборотах в минуту, убирали надосадочную жидкость и ресуспендировали осадок. Далее к нему добавляли предварительно нагретый до 37˚С гипотонический раствор (0,55% раствор KCl). Гипотонизация проводилась в термостате в течение 30 минут. Далее клетки центрифугировали, удаляли надосадочную жидкость, осадок ресуспендировали и подвергали фиксации. В качестве фиксирующей смеси использовали 98% этанол и ледяную уксусную кислоту в соотношении 3:1. Первую фиксацию проводили при температуре – 10˚С в течение 20 минут. Затем фиксатор сменяли 2-3 раза с промежуточным центрифугированием. Показателем завершенности фиксации служила бесцветность, прозрачность клеточной суспензии. Полученную взвесь раскапывали на охлажденные химически чистые предметные стекла.

После высушивания препараты маркировали и до окраски хранили при комнатной температуре [1].

Микроскопирование препаратов с целью проверки качества проводили с помощью микроскопа «ZEISS» (увеличение окуляра 10, увеличение объектива 90).

Рисунок 1. Метафазная пластинка хромосом белой лабораторной крысы

Список литературы:

1. Карпишенко А.И. Медицинская лабораторная диагностика: программы и алгоритмы: справочник / под ред. А.И. Карпишенко. – СПб.: Интермедика, 1997. – 304 с.: ил.
2. Медведев Н.Н. Практическая генетика. — М.: Наука, 1968. — 294 с.
3. Оценка мутагенности новых лекарственных средств: Методические рекомендации. М., 1994. — 20 с.
4. Хромосомы человека: атлас / А.Ф. Захаров, В.А. Бенюш, Н.П. Кулешов, Л.И. Барановская; АМН СССР. – М.: Медицина, 1982. - 264 с. с ил.
5. Chuang C.H., Hu M.L. Use of whole blood directly for single-cell gel electrophoresis (comet) assay in vivo and white blood cells for in vitro assay // Mutant Res,. 2004; 564, 75–82.