О РОЛИ МУСКАРИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ АЦЕТИЛХОЛИНА В ОСУЩЕСТВЛЕНИИ МОТОРНОЙ ПРОГРАММЫ ПЛАВАНИЯ НЕМАТОДЫ CAENORHABDITIS BRIGGSAE

ON THE ROLE OF MUSCARINIC CHOLINORECEPTORS IN REALIZATON OF SWIMMING MOTOR PROGRAMME OF NEMATODE Caenorhabditis briggsae

Anastasia Egorova

junior Researcher of the Laboratory of Experimental Ecology in the Research Institute for Problems of Ecology and Mineral Wealth Use of Tatarstan Academy of Sciences,

Russia, Kazan

Dilyara Khakimova

PhD in Medicine, Senior Lecture of the Department of Morphology and General Pathology of the Institute of Fundamental Medicine and Biology, Kazan Federal University,

Russia, Kazan

Tatiana Kalinnikova

PhD in Biology, Head of the Laboratory of Experimental Ecology in the Research Institute for Problems of Ecology and Mineral Wealth Use of Tatarstan Academy of Sciences,

Russia, Kazan

Marat Gainutdinov

professor, DPhil in Biology, Senior Researcher of the Laboratory of Experimental Ecology in the Research Institute for Problems of Ecology and Mineral Wealth Use of Tatarstan Academy of Sciences,

Russia, Kazan

АННОТАЦИЯ

Исследовано влияние антагониста мускариновых рецепторов атропина и агониста этих рецепторов ареколина на поведение почвенной нематоды C. briggsae. Показано, что как ингибирование мускариновых рецепторов, так и их гиперактивация вызывает нарушения моторной программы плавания нематоды. Чувствительность к атропину и ареко­лину увеличивается двухчасовым голоданием нематод. Результаты работы показывают участие мускариновых рецепторов в регуляции локомоции C. briggsae.

ABSTRACT

The influence of antagonist of muscarinic cholinoreceptors atropine and their agonist arecoline on behavior of soil nematode C. briggsae was investigated. It is shown that both inhibition of muscarinic cholinoreceptors and their hyperactivation caused disorders of motor programme of nematode swimming. The sensitivity to atropine and arecoline was increased by 2-hours starvation of nematode. Results of this research show participation of muscarinic cholinoreceptors in regulation of C. briggsae locomotion.

Ключевые слова: Caenorhabditis briggsae, поведение, ареколин, атропин, мускариновые рецепторы ацетилхолина.

Keywords: Caenorhabditis briggsae, behavior, arecoline, atropine, muscarinic cholinoreceptors.

Холинергическая система играет ключевую роль в регуляции всех основных функций организмов человека и животных. Ацетилхолин (АХ) является единственной сигнальной молекулой в холинергических системах как человека, так и животных. АХ используется в регуляции функций организмов человека и животных в качестве как нейро­трансмиттера, так и нейромодулятора [2, 11]. Два основных типа рецепторов АХ – это никотиновые рецепторы (н-холинорецепторы) и мускариновые рецепторы (м-холинорецепторы), которые являются соответственно лигандзависимыми ионными каналами и рецепторами, сопряженными с несколькими типами G-белков [2–9, 11–12]. Если н‑холинорецепторы в основном принимают участие в быстрой синап­тической трансмиссии [2, 11], то при активации м-холинорецепторов происходят относительно медленные и длительные изменения клеток-мишеней [5–6]. В организме человека идентифицировано пять подтипов м-холинорецепторов (M₁, M₂, M₃, M₄ и M₅) [5–6], а у C. elegans известно три подтипа этих рецепторов (GAR-1, GAR-2 и GAR-3) [4, 7–9, 12]. В организмах человека и грызунов м-холинорецепторы играют ключевую роль в регуляции ацетилхолином функций сердца и гладких мышц, осуществляемой вегетативной нервной системой, и в когнитивных функ­циях центральной нервной системы [5–6]. В современных исследованиях функций холинергической системы нематод м-холинорецепторам при­дается сравнительно малое значение. Одним из подходов к исследованию роли м-холинорецепторов в функциях организмов животных является изучение влияние на эти функции агонистов и антагонистов рецепторов. Поэтому целью этой работы попытка выявить возможную роль м‑холинорецепторов в регуляции локомоции почвенной нематоды Caenorhabditis briggsae исследованием влияния антагониста м-холино­рецепторов атропина и их агониста ареколина на плавание нематоды, индуцированное механическим стимулом.

Методы и материалы

Эксперименты проводили с C. briggsae линии дикого типа AF16, предоставленной Caenorhabditis Genetics Center. Нематод выращивали при 21°C в чашках Петри со стандартной средой выращивания нематод и E.coli OP50 для кормления [1]. Нематод двухдневного возраста трижды отмывали 10 мл NG буфера (0,3 % NaCl, 1 мМ CaCl₂, 1 мМ MgSO₄, 25 мМ калийфосфатного буфера (pH 7,0)) и переносили индивидуально в пробирки с 1 мл NG буфера с добавлением атропина или ареколина. Изменения поведения, вызванные атропином и ареколином, регистри­ровали в течение 90 минут с использованием стереоскопического микроскопа SMZ-05. Дополнительно проводились эксперименты, в которых исследовалось влияние атропина и ареколина на чувстви­тельность поведения к действию ингибитора ацетилхолинэстеразы (АХ-эстеразы) алдикарба. В этих экспериментах регистрировались нарушения поведения, вызванные 15-минутной экспозицией нематод к алдикарбу. Показателем действия атропина, ареколина и алдикарба на поведение C.elegans являлось нарушение моторной программы плавания, индуцированного механическим стимулом (встряхивание про­бирки с червем). Эти нарушения проявлялись в нарушениях координации мышц, необходимой для синусоидальных движений тела, временной приостановке плавания и плавании по кругу. В каждом варианте эксперимента использовано 30 червей. Эксперименты проводили в трех повторностях. Статистическую обработку результатов проводили с использованием углового преобразования Фишера φ*. В работе использовали реактивы фирмы Sigma.

Результаты и обсуждение

Как показано в табл. 1, введение в среду атропина вызывает дозозависимые нарушения моторной программы плавания C. briggsae, индуцированного механическим стимулом. Эти нарушения проявляются в нарушениях координации сокращения и расслабления мышц тела, необходимой для синусоидальных движений тела при плавании, и развиваются в течение 90 минут экспозиции нематод к атропину. Чувствительность поведения к действию атропина увеличивается после двухчасовой инкубации нематод индивидуально в отсутствии пищи (E. coli OP50). Это увеличение проявляется в двукратном снижении концентрации атропина, эффективной для нарушения моторной прог­раммы плавания, индуцированного механическим стимулом (табл. 1).

Таблица 1.

Нарушения моторной программы плавания C. briggsae атропином

Известно, что атропин чрезвычайно токсичен при введении в организмы человека и грызунов из-за нарушения функций сердечно-сосудистой системы, обусловленного блокированием м-холинорецеп­торов в сердце и сосудах. В то же время в простых организмах почвенных нематод рода Caenorhabditis сердечно-сосудистая система отсутствует. Поэтому негативное влияние атропина на локомоцию C. briggsae отражает нарушения функций нейронов, принимающих участие в регуляции локомоции или мышц тела, сокращение и расслабление которых необходимо для синусоидальных движений тела при плавании. В связи с тем, что атропин является антагонистом всех пяти подтипов м-холинорецепторов позвоночных, но только один из трех подтипов м-холинорецепторов близкородственной C. briggsae нематоды C. elegans (GAR-3) эффективно блокируется действием атропина. GAR-1 частично чувствителен к атропину, а GAR-2 полностью не чувствителен к нему [7]. Поэтому нарушения моторной программы плавания, вызванные атропином, свидетельствуют о том, что активация рецепторов GAR-1 и GAR-3 является одним из механизмов реализации этой программы в организме C. briggsae.

Таблица 2.

Нарушения моторной программы плавания C. briggsae ареколином

Как показано в табл. 2, не только ингибирование, но и гиперакти­вация м-холинорецепторов C. briggsae вызывает нарушения локомоции, так как введение в среду агониста м-холинорецепторов нематод ареколина нарушает моторную программу плавания C. briggsae, и это нарушение, так же, как при действии атропина развивается в течение 90 минут экспозиции к ареколину. Сходство в действии атропина и ареколина проявляется и в том, что в обоих случаях чувствительность поведения к их действию увеличивается двухчасовой инкубацией нематод индивидуально в жидкой среде без пищи (табл. 1–2).

Два возможных объяснения кажущегося парадокса однонаправ­ленного действия блокатора м-холинорецепторов атропина и агониста этих рецепторов ареколина на поведение C. briggsae, проявляющегося в нарушениях моторной программы плавания, заключаются в следующем:

1.  Для реализации этой программы необходим оптимальный уровень активации метаботропных м-холинорецепторов в нейронах и мышцах тела, и этот уровень нарушается как ингибированием, так и гиперактивацией этих рецепторов. Поэтому оба этих воздействия на активность м-холинорецепторов нарушают моторную программы плавания C. briggsae (табл. 1–2).

2. Известно, что более половины нейронов в простых нервных системах нематод рода Caenorhabditis являются холинергическими [10]. Холинергическими являются и многие нейроны, регулирующие локо­моцию нематод, такие как командные нейроны и моторные нейроны. Гены м-холинорецепторов экспрессируются во многих нейронах нематод и в мышцах тела [8, 12], причем так же, как у позвоночных в нейронах нематод часто экспрессируются гены двух подтипов м-холинорецепторов, белковые продукты которых оказывают противоположно направленное действие на функции нейрона. Поэтому возможным объяснением одно­направленного действия антагониста м-холинорецепторов атропина и их агониста ареколина с противоположно направленным действием на холинергическую синаптическую трансмиссию может быть множест­венность м-холинорецепторов в системе нейронов, регулирующей локомоцию.

Сенситизация локомоции C. briggsae к действию атропина и ареколина (табл. 1–2) двухчасовой инкубацией нематод в жидкой среде без пищи может быть следствием сильного влияния кратковременного голодания на холинергическую систему. Как показано в табл. 3, после двухчасовой инкубации C. briggsae в среде без E. coli происходит четырехкратное повышение чувствительности поведения к частичному ингибированию АХ-эстеразы.

Многочисленные исследования молекулярных механизмов функций холинергической системы нематод свидетельствуют о том, что чувстви­тельность локомоции нематод к алдикарбу отражает изменения актив­ности холинергической синаптической трансмиссии, и сенситизация локомоции к алдикарбу является следствием увеличения скорости секреции ацетилхолина нейронами или увеличения чувствительности н-холинорецепторов в мышцах тела или нейронах.

Таблица 3.

Влияние двухчасового голодания на чувствительность C. briggsae к алдикарбу

Результаты работы позволяют сделать следующие выводы:

1.  Активация метаботропных м-холинорецепторов является одним из механизмов осуществления моторной программы плавания нематоды C. briggsae.

2.  Фармакологический анализ локомоции C. briggsae с исполь­зованием агонистов и антагонистов м-холинорецепторов может быть использован для последующей идентификации подтипов м-холинорецепторов, принимающих участие в регуляции локомоции.

Список литературы:

1. Brenner S. The genetics of Caenorhabditis elegans // Genetics. – 1974. – V. 77. – P. 71–94.
2. Changeux J.P., Edelstein S.J. Allosteric receptors after 30 years // 1998. – Neuron. – V. 21. – P. 959–980.
3. Culetto E., Baylis H.A., Richmond J.E., Jones A.K., Fleming J.T., Squires M.D., Sattelle D.B. The Caenorhabditis elegans unc-63 gene encodes a levamisole-sensitive nicotinic acetylcholine receptor α subunit // The Journal of Biological Chemistry. – 2004. – V. 279. – P. 42476–42483.
4. Kim S., Shin Y., Shin Y., Park Y-S., Cho N.J. Regulation of ERK1/2 by the C.elegans muscarinic acetylcholine receptors GAR-3 in Chinese hamster ovary cells // Molecules and Cells. – 2008. – V. 25. – P. 504–509.
5. Langmead C.J., Watson J., Reavill C. Muscarinic acetylcholine receptors as CNS drug targets // Pharmacology & Therapeutics. – 2008. – V. 117. – P. 232–243.
6. Lanzafame A.A., Christopoulos A., Mitchelson F. Cellular signaling mechanism for muscarinic acetylcholine receptors // Receptors and Channels. – 2003. – V. 9. P. 241–260.
7. Lee Y.S., Park Y.S., Nam S., Suh S.J., Lee J., Kaang B.K., Cho N.J. Characterization of GAR-2, a novel G protein-linked acetylcholine receptor from Caenorhabditis elegans // Journal of Neurochemistry. – 2000. – V. 75. – P. 1800–1809.
8. Liu Y., LeBoeuf B., Garcia L.R. Gαq-coupled muscarinic acetylcholine receptors enhance nicotinic acetylcholine receptor signaling in Caenorhabditis elegans mating behavior // The Journal of Neuroscience. – 2007. – V. 27. – P. 1411–1421.
9. Park Y-S., Kim S., Shin Y., Choi B., Cho N.J. Alternative splicing of the muscarinic acetylcholine receptor GAR-3 in Caenorhabditis elegans // Biochemical and Biophysical Research Communications. – 2003. – V. 308. – P. 961–965.
10. Pereira L., Kratsios P., Serrano-Saiz E., Sheftel H., Mayo A.E., Hall D.H., White J.G., LeBoeuf B., Garcia L.R., Alon U., Hobert O. A cellular and regulatory map of the cholinergic nervous system of C. elegans // eLife. – 2015. – V. 4. – P. e12432.
11. Satelle D.B. Invertebrate nicotinic acetylcholine receptors – targets for chemicals and drugs important in agriculture, veterinary medicine and human health // Journal of Pesticides Science. – 2009. – V. 34. – P. 233–240.
12. Steger K., Avery L. The GAR-3 muscarinic receptor cooperates with calcium signals to regulate muscle contraction in the Caenorhabditis elegans pharynx // Genetics. – 2004.  – V. 167. – P. 633–643.