ПОВЕРХНОСТНЫЙ МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ИМПРИНТИНГ АМИНОКИСЛОТ

SURFACE MOLECULAR IMPRINTING OF AMINO ACIDS

Darya Slepchenko Alexandrovna

4th year student of Surgut State University, direction 04.03.01. “Chemistry”

Russia, Surgut

Paul Evelina Sergeevna

4th year student of Surgut State University, direction 04.03.01. “Chemistry”

Russia, Surgut

АННОТАЦИЯ

Поверхностный молекулярный импринтинг — это эффективный метод создания полимеров с высокой селективностью и адсорбционной способностью для распознавания аминокислот. Этот метод имеет преимущества перед традиционными подходами и находит применение в биоаналитике. В работе описывается метод поверхностного молекулярного импринтинга для создания полимерных материалов, способных распознавать определенные молекулы, такие как аминокислоты. Этот метод использует молекулы-шаблоны, которые оставляют полости в полимерной матрице, позволяющие селективно захватывать аналогичные молекулы. Исследование включает синтез, анализ и характеристику таких материалов с использованием различных методик, таких как ИК-спектроскопия и лазерная дифракция.

ABSTRACT

Surface molecular imprinting is an efficient method to create polymers with high selectivity and adsorption capacity for amino acid recognition. This method has advantages over conventional approaches and finds application in bioanalytical applications. This work describes a surface molecular imprinting method to create polymeric materials capable of recognizing specific molecules such as amino acids. This method utilizes template molecules that leave cavities in the polymer matrix that allow selective capture of similar molecules. The research involves the synthesis, analysis and characterization of such materials using various techniques such as IR spectroscopy and laser diffraction.

Ключевые слова: поверхностный молекулярный импринтинг, полимерные материалы, молекулы-шаблоны, аминокислоты, ИК-спектроскопия, лазерная дифракция, золь-гель метод.

Keywords: surface molecular imprinting, polymeric materials, template molecules, amino acids, IR spectroscopy, laser diffraction, sol-gel method.

Введение

Поверхностный молекулярный импринтинг (ПМИ) — это метод создания полимерных материалов, способных распознавать определенные молекулы в растворе [1]. Он основан на использовании молекул-шаблонов, которые импрегнируются в полимерную матрицу в процессе ее синтеза. После удаления молекул-шаблонов из матрицы остаются полости, имеющие форму и размеры, соответствующие молекулам-шаблонам. Эти полости обладают специфической аффинностью к молекулам-шаблонам и могут использоваться для селективного захвата и распознавания аналогичных молекул в растворе.

Полимеры с молекулярными отпечатками (МИП) вызвали широкий интерес в области биоанализа как «искусственные антитела» [2]. Они могут имитировать биологические рецепторы путем избирательного распознавания и адсорбции молекул-мишеней благодаря их специфическому сродству к мишеням [3]. Традиционные МИП, полученные методом объемного импринтинга, имеют некоторые недостатки, включая низкую адсорбционную способность, плохую доступность сайтов связывания, ограниченный массоперенос и неправильную морфологию. Поверхностно молекулярно импринтированные полимеры отличаются большой площадью поверхности, обеспечивают быстрый массообмен и обладают высокой адсорбционной способностью и эффективностью. Благодаря этим преимуществам они интенсивно использовались в исследованиях аминокислот [4-6].

В статье [1] твердый полимер, который молекулярно отпечатывается на поверхности внутренней полости, получают полимеризацией эмульсий типа "вода в масле" (безмасляная эмульсия), состоящих из водорастворимой отпечатанной молекулы, функциональной молекулы-хозяина, стабилизатора эмульсии и сшивающего агента. Граница раздела органическая-водная в безводных эмульсиях используется в качестве поля распознавания молекулы-шаблона. Молекула-шаблон образует комплекс с функциональной молекулой-хозяином, в то время как ориентация самой функциональной молекулы-хозяина фиксирована на границе раздела масло-вода.

После полимеризации препарат обеспечивает сайты распознавания на внутренней поверхности полости отпечатанного объемного полимера. Комплекс между функциональной молекулой-хозяином и материалом-шаблона не должен быть слишком гидрофобным или гидрофильным, поскольку в противном случае комплекс не был бы расположен на границе раздела масло-вода.

Таким образом, функциональная молекула-хозяин должна быть амфифильной, точно так же, как и молекула поверхностно-активного вещества, чтобы обеспечить высокий эффект матрицы для молекулы-шаблона. Сшивающий агент сшивает органическую фазу и стабилизирует запечатленную водяную полость после полимеризации. Полученный объемный полимер измельчают до мелких частиц, чтобы взаимодействовать с молекулами-шаблонами в растворе.

Итак, в исследовании [1] диолеоилфосфат использовали в качестве стабилизатора эмульсии, и это соединение также действовало как мономер и функциональная группа-хозяин в отпечатанной полости. В качестве сшивающего вещества использовали дивинилбензол. Метиловый эфир триптофана и метиловый эфир фенилаланина использовались в качестве материалов-шаблонов. Эти отпечатанные полимеры проявляли энантиомерную селективность в экспериментах по абсорбции, и максимальный коэффициент разделения составлял 1.58. Энантиомерная селективность с метиловым эфиром триптофана была выше, чем с метиловым эфиром фенилаланина.

Из вышесказанного следует, что импринтирование аминокислот в полимерную матрицу улучшает стабильность и устойчивость материалов к различным факторам, таким как температура и влажность. Это повышает долговечность и надежность материалов, что является важным фактором для их успешного применения в различных областях. 

Следовательно, разработка методов ПМИ аминокислот в полимерную матрицу является актуальной задачей, которая может привести к созданию новых высокоэффективных материалов для различных приложений в биохимии, медицине и других областях.

Цель работы: получение селективного молекулярно-импринтированного слоя на поверхности силикагеля, специфичного к молекуле глутаминовой кислоты.

Достижение поставленной цели предусматривает решение следующих задач:

1. Синтез поверхностно молекулярно импринтированного кремнезема с отпечатками глутаминовой кислоты методом золь-гель синтеза.
2. Характеризация полученных импринтированных силикагелей с помощью комплекса физико-химических методов (ИК-спектроскопия, лазерная дифракции).

Материалы и методы исследования

Исходные вещества, посуда

В работе использовали следующие исходные вещества: соляная кислота (х. ч., АО «Башкирская содовая компания»); силикагель ( 75-150мкм, pore size 30A, Sigma-Aldrich); натрия гидроокись (х. ч., ОАО «БСК»); глутаминовая кислота (C₅H₉NO₄), фарм. ; диметилсульфоксид (х. ч., ОАО «ХРС»; тетраэтоксисилан (ос. ч., АО «Экос-1»; (3-аминопропил) триэтоксисилан (98.0%, Aldrich).

В ходе работы использовали следующую посуду: конические колбы объемом 100 мл, мерные колбы объемом 50 мл, центрифужные пробирки, стеклянные палочки, стаканы объемом 50 и 100 мл.

Оборудование

В процессе работы использовали следующее оборудование: рН-метр (ЭКОТЕСТ - 120) для контроля рН на этапе активации носителя SiO₂; ИК-спектрофотометр UV-2600 (SHIMADZU) для определения функциональных групп в образцах; гидравлический пресс для изготовления таблетки, используемой в ИК - спектрофотометрии; лазерный дифракционный анализатор размеров частиц SALD-2300 (SHIMADZU) для анализа распределения частиц по размерам; магнитная мешалка; центрифуга.

Методики эксперимента

Методика (1) синтеза поверхностно молекулярно-импринтированного мезопористого кремнезема с отпечатками глутаминовой кислоты включает в себя 4 этапа:

1) Активация носителя (SiO₂)

Суспензию 4.5 г SiO₂ в 50 мл 6 M HCl перемешивали в течение 5 ч на магнитной мешалке. Жидкость удалили декантацией. Порошок залили дистиллированной водой, перенесли суспензию количественно в центрифужные пробирки, центрифугировали (10 мин, 7000 об/мин). Повторяли процедуру до нейтральной среды центрифугата (pH воды контролировали с помощью pH-метра). По окончании рН составил 5.850. Полученный порошок высушили при 70°С.

2) Импринтинг

0.1471 (1 ммоль) глутаминовой кислоты растворили в 15 мл ДМСО и 5 мл деионизированной воды в пластиковом стаканчике. После полного растворения молекулы-шаблона добавили 0.235 мл (1 ммоль) 3-аминопропилтриэтоксисилана и 2.240 мл (10.1 ммоль) тетраэтоксисилан. Затем добавили 0.0200 г NaOH, 2.0 г активированного SiO₂ и выдержали при постоянном перемешивании (магнитная мешалка) и температуре 40°С в течение 6 ч. Немолекулярно импринтированный полимер (НИП) синтезировали в аналогичных условиях без добавления молекулы-шаблона.

3) Отмывка после синтеза

Порошок отделили декантацией. Промыли последовательно этиловым спиртом (2 раза по 15 мл) и дистиллированной водой (порциями по 15 мл) до нейтральной среды (pH водных растворов контролировали с помощью pH-метра). Высушили порошок при 80°С.

4) Отмывка от молекулы-шаблона:

Молекулы-шаблоны элюировали последовательно 50 мл смеси этанол: 10% HCl (1:1, об. /об.), 50 мл этанола и 50 мл воды при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в течение 30 мин

Методика (2) анализа МИП и НИП методом ИК-спектроскопии:

Образец массой 0.005 г перетерли в ступке с бромидом калия (KBr) массой 0.5 г. Далее из полученного порошка формировали таблетку с помощью гидравлического пресса (давление 5.5 т). Сформированную таблетку поместили в ИК-спектрофотометр для снятия спектра в режиме пропускания. Диапазон: 4000–400 см^-1. Разрешение: 2.00 см^-1.

Методика (3) пробоподготовки для определения размера частиц методом лазерной дифракции:

Отобрали навески образцов МИП массой 0.0101 г, а НИП - 0.0104 г. Диспергировали их в 2 мл водного раствора ПАВ (0.1%), затем обработали ультразвуком в течение 3 мин.

Результаты и обсуждение

Поверхностный молекулярный импринтинг аминокислот в кремнезем золь-гель методом

Для активации носителя отобрали навеску SiO₂ массой 4.5103 г. По окончании этого процесса масса высушенного вещества составила 4.1003 г, то есть потери на этом этапе равны 0.4100 г.

Глутаминовую кислоту растворили в ДМСО и деионизированной воде. Далее добавили 3-аминопропилтриэтоксисилана и тетраэтоксисилан. Затем добавили NaOH, активированного SiO₂ и выдержали при постоянном перемешивании и температуре 40°С. НИП синтезировали в аналогичных условиях без добавления молекулы-шаблона.

На этапе импринтинга, для синтеза МИП и НИП взяли массы носителя 2.0034 г и 2.0057 г соответственно. По завершению отмывки массы готовых МИП и НИП составили 2.1285 г для первого и 1.9370 г для второго.

Таким образом, удалось эффективно синтезировать МИП и НИП для дальнейшего анализа.

Исследование поверхностно молекулярно-импринтированного кремнезема методами ИК-спектроскопии и лазерной дифракции

По окончании синтеза провели исследование поверхностно молекулярно-импринтированного кремнезема методами ИК-спектроскопии и лазерной дифракции.

В ходе анализа методом ИК-спектроскопии получили ИК-спектры, представленные на рис. 1 и 2. Результаты расшифровки ИК-спектров представлены в табл. 1, 2.

Рисунок 1. ИК-спектр неимпринтированного кремнезема

Таблица 1.

 Идентификация полос поглощения образца НИП кремнезема

Рисунок 2. ИК-спектр импринтированного кремнезема

Таблица 2.

Идентификация полос поглощения образца НИП кремнезема

Таким образом, в ИК-спектрах поглощения МИП и НИП образцов кремнезема удалось идентифицировать полосы поглощения, соответствующие валентным колебаниям связи Si-O (1087 см^-1; 1084.5 см^-1), характерными для кремнезема, который при проведении синтеза являлся носителем. Данный пик является более выделяющимся в диапазоне 1200–1000 см^-1 на рис. 1 и 2.

Методом лазерной дифракции определили размер частиц образцов кремнезема. Результаты представлены на рис. 3–5 и в табл. 3.

Рисунок 3. Объемное распределение по размерам частиц исходного кремнезема

Рисунок 4. Объемное распределение по размерам частиц НИП

Рисунок 5. Объемное распределение по размерам частиц МИП

Таблица 3.

Параметры объемного распределения частиц поверхностно импринтированного кремнезема по размерам

В процессе синтеза размер частиц увеличился (это видно из сравнения размера частиц исходного вещества с размерами НИП и МИП), а также увеличилось количество частиц соответствующих наиболее распространенному размеру частиц (100.6 мкм), что подтверждают данные из табл. 3. Распространение частиц по размеру неоднородно, об этом можно судить по медиане. Существенные различия между МИП и НИП имеются, это выражено в значениях медианы и среднего диаметра. Это обусловлено в составе МИП молекул-шаблонов.

Заключение

В ходе работы был проведен поверхностный молекулярный импринтинг глутаминовой кислоты в кремнезем золь-гель методом.

При анализе методом ИК-спектрофотометрии удалось идентифицировать колебания по функциональным группа, которые соответствовали возможному элементному составу. Также наблюдались изменения в интенсивности и положении ИК пиков между импринтированным и неимпринтированным кремнеземом, что связано с взаимодействием функциональных групп глутаминовой кислоты с поверхностью кремнезема в процессе импринтинга.

Методом лазерной дифракции исследовали размеры частиц и их распределение. Этот анализ показал, что образцы имеют достаточно малый размер, что характерно для частиц, получаемых золь-гель методом. После проведения молекулярного импринтинга размер частиц немного увеличился, что может быть связано с формированием слоя полимера на поверхности частиц.

Таким образом, полученные результаты подтверждают успешный синтез поверхностного молекулярного импринтинга глутаминовой кислоты в кремнеземе золь-гель методом.

Список литература

1. Recognizing Amino Acid Chirality with Surface-Imprinted Polymers Prepared in W/O Emulsions / M. Shin, Y. Shin, S. Hwang, J. Shin // International Journal of Polymer Science. – 2013. – V. 2013. – Art. № 290187.
2. Synthesis, characterization, and application of griseofulvin surface molecularly imprinted polymers as the selective solid phase extraction sorbent in rat plasma samples / K. Bashir, P. Guo, G. Chen [et al.] // Arabian Journal of Chemistry. – 2020. – V. 13. – P. 4082–4091.
3. Preparation of molecularly imprinted polymers specific to glycoproteins, glycans and monosaccharides via boronate affinity controllable–oriented surface imprinting / R. Xing, S. Wang, Z Bie [et al.] // Nature Protocols. – 2017. – V. 12. – P. 964–987.
4. A review: Development and application of surface molecularly imprinted polymers toward amino acids, peptides, and proteins / W. Zhang, Y. Zhang, R. Wang [et al.] // Analytica Chimica Acta. –  2022. –  V. 1234. – Art. № 340319.
5. Молекулярный импринтинг: инструмент современной химии для получения высокоселективных сорбентов монолитного типа / Е.Г. Влах, В.А. Коржиков, А.В. Губина, Т.Б. Тенникова // журнал: Успехи химии – 2015. –  Т. 84. – Выпуск. № 9. – С. 952–980.
6. Preparation of Molecule Imprinted Membrane of Single Enantiomer of Amino Acid with an Innovative Strategy and Study on its Chiral Recognition and Resolution Properties / B. Gao, K. Cui, Y. Li // Journal of Chemical Technology & Biotechnology. – 2017. – V. 1443. – P. 1566-1576.
7. Определение строения органических соединений. Таблицы спектральных данных / Э. Преч, Ф. Бюльманн, К. Аффольтер; пер. с англ. Б. Н. Тарасевича. – Москва: Издательство Мир, Бином. Лаборатория знаний. – 2006. – С. 251–318.
8. Справочные материалы, ИК спектры основных классов органических соединений / Б. Н. Тарасевич. – Москва: МГУ имени М. В. Ломоносова химический факультет, кафедра органической химии. – 2012.