ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ЗНАЧИМОСТИ ПОДАВЛЕНИЯ ГЕНА PIRATE В СЕМЕННИКАХ DROSOPHILA MELANOGASTER

АННОТАЦИЯ

Цель данной работы – оценить влияние дополнительной экспрессии и делеции гена pirate на фертильность самцов Drosophila melanogaster. Для этого с помощью генетических и молекулярно-биологических подходов были получены соответствующие линии мух. В результате анализа не было выявлено значимого влияния гена на фертильность. Таким образом, используемый нами подход не позволяет выявить функциональную роль подавления гена pirate в семенниках с помощью piРНК и требуются дальнейшие исследования в данном направлении

Ключевые слова: piРНК; эпигенетика; Y-хромосома; белок-кодирующие гены.

Поддержание целостности генома – одно из ключевых свойств живых организмов. Одним из механизмов поддержания стабильности генома является piРНК путь, который функционирует в герминальных клетках и консервативен от гидры до человека. piРНК (Piwi-взаимодействующие РНК) – это малые некодрующие РНК, которые производятся со специализированных участков генома, piРНК кластеров, в виде длинного предшественника, который затем созревает в цитоплазме. piРНК в комплексе с белками семейства ARGONAUTE, подсемейства PIWI за счет комплементарности узнают свои мишени и разрезают их. Основной мишенью piРНК пути являются транспозоны, избыточная активность которых может приводить к встройкам в важные участки генома, разрывам и перестройкам ДНК, а также стерильности [1, 6]. Однако в последние годы появляется все больше информации о роли piРНК в регуляции белок-кодирующих генов. Так, например, показано участие piРНК в регуляции прото-онкогенов Cbl [2] и c-fos [3] у Drosophila, а также ряда генов у мыши [7]. Нами было продемонстрировано участие piРНК в формировании репродуктивных барьеров и гибридной стерильности у Drosophila melanogaster и Drosophila mauritiana с участием двух других генов – vasa и Stellate [4]. Недавно мы обнаружили регуляцию еще одного гена - pirate, который подавляется в зависимой от пола манере в гонадах Drosophila. Этот ген кодирует SUMO-изопептидазу. В случае D. melanogaster ген pirate экспрессируется везде за исключением семенников. Короткие piРНК к этому гену производятся с локуса, расположенного на Y-хромосоме и названного нами Petrel [5].

Поскольку функции и необходимость зависимого от пола подавления гена pirate неизвестны в гонадах Drosophila, в данной работе с использованием генетических и молекулярно-биологических подходов мы решили оценить влияние этого гена на фертильность самцов D. melanogaster. Для оценки влияния дерепрессии гена pirate нами была использована трансгенная линия мух, содержащия рекодированный ген pirate (piraR), что позволяет ему избегать подавления с помощью коротких РНК. Мы провели анализ влияния дополнительной копии pirate на фертильность самцов (рисунок 1). При этом в качестве положительного контроля мы использовали мух с мутацией в гене aub, который является одним из основных участников piРНК пути. Мухи гетерозиготные по мутации в гене aub были использованы в качестве отрицательного контроля. Посредством генетических скрещиваний была получена линия мух, где piraR был перенесен в то же геномное окружение, чтобы избежать влияния генетического фона. По результатам анализа можно утверждать, что на уровне статистической значимости p = 0,05 (U-критерия Манна-Уитни) экспрессия гена pirate не влияет на репродуктивную функцию самцов D. melanogaster в исследуемом геномном окружении.

Рисунок 1. Результат сравнительного анализа фертильности самцов условно дикого генотипа (aub +/-, n = 29), с нарушенным piРНК путем (aub -/-, n = 22) и опытных мух, содержащих рекодированный ген pirate на том же генетическом фоне (aub +/-; piraR, n = 17). ns – незначимо, * p-value<0.05

Помимо этого мы провели анализ влияния делеции локуса, содержащего эндогенный ген pirate, в динамике (рисунок 2). Для этого мы оценивали фертильность самцов во временном окне 0-3, 3-6, 9-12 и 12-15 дней по количеству потомков от каждого индивидуального самца со следующими генотипами в нескольких повторностях: с делецией pirate (Δpira, n = 13), гетерозиготных (aub +/-, n = 9) и гомозиготных (aub -/-, n = 11) по мутации в гене aub, а так же самцов с двойной мутацией (aub -/-; Δpira, n = 12). Полученные результаты демонстрируют отсутствие значимых различий в фертильности самцов условно дикого типа (aub +/-) и мух с делецией pirate.

Рисунок 2. Результат анализа динамики фертильности самцов с делецией локуса, содержащего эндогенный ген pirate. Линии показывают динамику, полупрозрачная заливка – стандартное отклонение

Оценка влияния делеции pirate на фертильность в случае нарушенного piРНК пути (aub -/- против aub -/-, Δpira) показывает незначимое увеличение потомков во временном интервале 3-6 дней. Однако в целом можно сказать, что делеция pirate не влияет на фертильность самцов мух на фоне мутации в гене aub.

Таким образом, используемый нами подход не позволил выявить функциональную роль подавления гена pirate в семенниках и требуются дальнейшие исследования в данном направлении.

Работа выполнена при поддержке гранта МК-1205.2022.1.4 Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых - кандидатов наук

Список литературы:

1. Aravin, A.A. The Piwi-piRNA pathway provides an adaptive defense in the transposon arms race / A.A. Aravin, G.J. Hannon, J. Brennecke // Science (New York, N.Y.). – 2007. – Vol. 318, №5851. – P.761–764.
2. Aubergine and piRNAs promote germline stem cell self-renewal by repressing the proto-oncogene Cbl / P. Rojas-Ríos, A. Chartier, S. Pierson, M. Simonelig // The EMBO journal. – 2017. – Vol. 36, №21. – P.3194–3211.
3. c-Fos Repression by Piwi Regulates Drosophila Ovarian Germline Formation and Tissue Morphogenesis / J.D. Klein, C. Qu, X. Yang [et al.] // PLoS genetics. – 2016. – Vol. 12, №9. – e1006281.
4. piRNA silencing contributes to interspecies hybrid sterility and reproductive isolation in Drosophila melanogaster / A.A. Kotov, V.E. Adashev, B.K. Godneeva [et al.] // Nucleic acids research. – 2019. – Vol. 47, №8. – P.4255–4271.
5. piRNA-mediated gene regulation and adaptation to sex-specific transposon expression in D. melanogaster male germline / P. Chen, A.A. Kotov, B.K. Godneeva [et al.] // Genes & development. – 2021. – Vol. 35, №11-12. – P.914–935.
6. Piwi induces piRNA-guided transcriptional silencing and establishment of a repressive chromatin state / A. Le Thomas, A.K. Rogers, A. Webster [et al.] // Genes & development. – 2013. – Vol. 27, №4. – P.390–399.
7. Y chromosomal noncoding RNAs regulate autosomal gene expression via piRNAs in mouse testis / H.M. Reddy, R. Bhattacharya, S. Tiwari [et al.] // BMC biology. – 2021. – Vol. 19, №1. – P.198.