БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ ШАЛФЕЯ ПУСТЫННОГО (SALVIA DESERTA)

BIOLOGICAL ACTIVITY OF SECONDARY METABOLITES OF DESERT SAGE (SALVIA DESERTA)

Laura Nurkhozhayeva

Master's student of the Department of Biology and Biotechnology Kazakh National University named after Al-Farabi,

Kazakhstan, Almaty

Dilnaz Bekkuliyeva

Master's student of the Department of Biology and Biotechnology Kazakh National University named after Al-Farabi,

Kazakhstan, Almaty

АННОТАЦИЯ

Цель: Изучение биологической активности вторичных метаболитов суммарного экстракта Salvia deserta.

Объект исследования: надземная часть Salvia deserta.

Методы: экстракция методом мацерации с помощью 70% этанола; выпаривание и сушка полученного экстракта в роторном испарителе; определение антимикробной и фунгицидной активностей экстракта методом серийных разведений в бульоне; определение антиоксидантного потенциала с использованием радикал-катионов ABTS•+.

Результаты: Суммарный экстракт Salvia deserta, полученный экстракцией 70% этанолом, показал активность по отношению к бактериям St.aureus и Ps.aeruginosa (IC₅₀ = 5,2 и 5,4 мкг/мл соответственно) и по отношению к дрожжеподобному грибку С.albicans (IC₅₀ = 6,6 мкг/мл); экстракт обладал средней антиоксидантной активностью, составившей 47,5% ингибирования ABTS•+ радикала в концентрации 100 мкг/мл;

Выводы:

1. Суммарный экстракт Salvia deserta обладает антибактериальной активностью по отношению к тест-объектам St.aureus и Ps.aeruginosa.

2. Суммарный экстракт Salvia deserta обладает фунгицидной активностью по отношению к тест-объекту C.albicans.

3. Суммарный экстракт Salvia deserta обладает средней антиоксидантной активностью.

ABSTRACT

Purpose: To study the biological activity of secondary metabolites of the total extract of Salvia deserta.

Object of study: aerial part of Salvia deserta.

Methods: extraction by maceration with 70% ethanol; evaporation and drying of the obtained extract in a rotary evaporator; determination of antimicrobial and fungicidal activities of the extract by serial dilutions in broth; determination of antioxidant potential using radical cations ABTS•+.

Results: The total extract of Salvia deserta, obtained by extraction with 70% ethanol, showed activity against the bacteria St.aureus and Ps.aeruginosa (IC₅₀ = 5.2 and 5.4 μg / ml, respectively) and against the yeast fungus C.albicans (IC₅₀ = 6.6 µg/mL); the extract had an average antioxidant activity of 47.5% inhibition of the ABTS•+ radical at a concentration of 100 μg/ml;

Conclusions:

1. The total extract of Salvia deserta has antibacterial activity in relation to the test objects St.aureus and Ps.aeruginosa.

2. The total extract of Salvia deserta has fungicidal activity in relation to the test object of C.albicans.

3. The total extract of Salvia deserta has an average antioxidant activity.

Ключевые слова: биологически активные соединения (БАС), суммарный экстракт, Salvia deserta, антимикробная активность, фунгицидная активность, антиоксидантная активность.

Keywords: biologically active compounds (BAC), total extract, Salvia deserta, antimicrobial activity, fungicidal activity, antioxidant activity.

Биологически активные вещества растений, представленные в виде первичных и вторичных метаболитов, являются важнейшими источниками соединений разнообразной органической природы, обладающих терапевтическими свойствами, необходимыми при создании лечебных и профилактических лекарственных средств. Более 200 видов растений семейства Lamiaceae, произрастающих в Казахстане обладают широким спектром биологической активности: антимикробной, фунгицидной, антиоксидантной, противовоспалительной, сосудорасширяющей, противоопухолевой, цитотоксической и т.д. [3, c. 132].

На данный момент более 40% лекарственных препаратов изготавливаются непосредственно из растительного сырья. Более 80% населения Земли, по данным всемирной организации здравоохранения, наиболее часто используют лекарственные препараты природного происхождения в целях медико-санитарной помощи [2, c. 23].

Род Salvia L. (шалфей) является издавна известным и часто используемым растением в народной медицине, пищевой, фармацевтической и парфюмерной промышленностях. Перспективным для практического использования является и Salvia deserta (шалфей пустынный). Биологическая ценность сырья Salvia deserta обуславливается комплексом БАС, таких как фенольные соединения, флавоноиды и терпены [9, с. 2].

Материалы и методы

В работе была использован растительный материал (надземная часть растения), собран в период в Алматинской области. Были применены стандартные методы заготовки, фиксации и подготовки к дальнейшим исследованиям образцов растений [4, c. 20].

В работе были использованы стандартные методы посева и культивирования микроорганизмов, определения антибактериальной активности и антиоксидантного потенциала суммарных экстрактов, полученных из фармакопейных растений фотометрическим методом.

Высушенное растительное сырье предварительно измельчалось, а после взвешивалось и помещалось в стеклянные ёмкости для экстракции 70% этанолом в соотношении сырье:растворитель не менее 1:10 (масса:объем) на 24 часа при постоянном помешивании на возвратно-поступательном шейкере GFL 3006. После полученный экстракт был отфильтрован и далее перенесен в роторный испаритель фирмы Stuart RE300P для удаления этанола как экстрагента, затем досушивался в случае необходимости под тягой в чашках Петри, после чего количественно был собран, взвешан и помещен в стеклянные флаконы для хранения [1, с. 944] [7, с. 515].

В исследовании были использованы следующие штаммы микроорганизмов: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans. Культивирование микроорганизмов проводилось на скошенном мясопептонном агаре (МПА) при 37^оС в течение 18 часов, а поддерживание на питaтельной сpeде при 4^оС. Для определения антибактериальной и фунгицидной активности суммарного экстракта использовались суточные культуры микроорганизмов [8, c. 236].

Антибактериальная активность суммарных экстрактов определялась методом серийных разведений в бульоне. Образцы растительного экстракта были растворены в диметилсульфоксиде (ДМСО), серийно разведены в смеси 20 % ДМСО с 0,9 % физиологическим раствором в пропорции 1:1, после чего вносились в пробирки в три повтора. Для инокуляции была использована стандартная микробная взвесь (эквивалентная 0,5 по стандарту МакФарланда), разведённая в 100 раз питательным бульоном до конечной концентрации клеток микроорганизмов 10⁶ КОЕ/мл. В пробирки, содержащие по 3 мл разведенного экстракта, были внесены по 3 мл инокулюма (конечная концентрация микроорганизмов - 5х10⁵ КОЕ/мл.). В качестве положительного контроля был использован питательный бульон с микроорганизмами со стандартной микробной взвесью. Отрицательным контролем являлись пробирки с 3 мл питательного бульона. Все исследуемые пробирки инкубировались при температуре 35^оС в течение 16-20 или 20-24 ч в зависимости от вида тестируемого микроорганизма. Пробирки с отрицательным контролем помещались в холодильник при 4^оС, где они хранились до окончания опыта. После завершения инкубации пробирки с образцами просматривались в проходящем свете при 551 нм на приборе Фотометр КФК-3-«ЗОМЗ» [5, c. 32]. Концентрация полумаксимального ингибирования (IC₅₀) была рассчитана при помощи программы GraphPad Prism.

Антиоксидантная активность суммарного экстракта измерялась фотометрически с использованием радикал-катионов ABTS•+ в качестве тестового свободного радикала [6, c. 1231]. Раствор ABTS•+ имеет стабильный зеленоватый окрас. Предположительно, антиоксиданты в составе тестируемого экстракта должны обезвредить катион-радикал ABTS•+, за счет чего происходит уменьшение оптической плотности раствора пропорционально своей концентрации в образце.

1 мл объёма экстракта добавлялся в 1 мл раствора ABTS•+. Далее измерялась оптическую плотность при 734 нм (длина волны, при которой наблюдается максимум поглощения для ABTS•+) используя спектрофотометр BioMate 3S, фирмы Thermo Scientific. Антиоксидантный потенциал определяют в процентах изменения поглощения ABTS•+.

Процентное ингибирование ABTS•+ вычисляется по формуле:

Ингибирование (%) = [(Aк - Aо): Aк] х 100                                                               (1)

где:

 Ак – абсорбция контрольного образца,

Ао – адсорбция опытного образца.

В качестве контроля была взята аскорбиновая кислота.

Далее снимается значение концентрации ABTS•+ спустя некоторое время для оценки активности экстракта. Снятие проводилось в промежутках: 1 минута, 5 минут, 15 минут, 30 минут, 60 минут, 90 минут, 120 минут соответственно.

Результаты исследования и их обсуждение

Суммарный экстракт был получен методом одноступенчатой экстракции этанолом. Количество используемого сухого материала - 50 г. В результате, из 50 г сырья, залитого 500 мл 70% этанола, было получено 1,6 г сухого экстракта.

Первичный скрининг антибактериальной активности проводился для экстракта в трёх повторностях. Взятая в эксперимент концентрация экстракта составила 100мкг/мл. Экстракт, добавленный в данной концентрации в среду культивирования тест-объектов, показал более чем 50% ингибирование роста всех трех тест-культур.

Таблица 1.

Первичный скрининг антимикробной активности экстракта Salvia deserta

По полученным данным в Таблице 1, можно сделать вывод, что суммарный экстракт Salvia deserta обладает антибактериальной активностью, ингибируя рост бактерий St.aureus    и Ps.aeruginosa на 61,3% и 67,9% соответственно. Помимо антибактериальной, была оценена фунгицидная активность суммарного экстракта в отношении тест-объекта Candida albicans, % ингибирования роста которого составил 59,3%.

Далее был проведен вторичный скрининг антибактериальной и фунгицидной активностей экстракта для установления концентрации полумаксимального ингибирования (IC₅₀). (Рисунок 1, Таблица 2)

Рисунок 1. Зависимость оптической плотности культур St.aureus (a), Ps.aeruginosa (б), C.albicans (в) от концентрации суммарного экстракта

На рисунке 1 отражены изменения оптической плотности в среде культивирования микроорганизмов в зависимости от концентрации суммарного экстракта. Чем ниже концентрация растительного экстракта, тем выше оптическая плотность, свидетельствующая о росте микроорганизмов.

Таблица 2.

Вторичный скрининг растительного экстракта Salvia deserta на антибактериальную и фунгицидную активности

Результат вторичного скрининга показал выраженную антимикробную и фунгицидную активности суммарного экстракта Salvia deserta:

1.      По отношению к St.aureus (IC₅₀ 5,2 мкг/мл);

2.      По отношению к Ps.aeruginosa (IC₅₀ 5,4 мкг/мл);

3.      По отношению к C.albicans (IC₅₀ 6,6 мкг/мл).

Таблица 3.

Антиоксидантная активность (АОА) экстракта и концентрация полумаксимального ингибирования свободного радикала ABTS•+ (IC₅₀), P<0,001

Рисунок 2.Антиоксидантная активность суммарного экстракта при ингибировании катион-радикала ABTS+

Данные по антиоксидантной активности суммарного экстракта Salvia deserta приведены в Таблице 3 и Рисунке 2. Стандарт веществом-антиоксидантом выступал раствор аскорбиновой кислоты при концентрации 100 мкг/мл.

Заключение

Растения являются одними из основных и широко исследуемых в настоящее время источников для создания новых эффективных лекарственных средств. К наиболее важным биологически активным соединениям растений семейства яснотковые относятся: фенольные соединения, кислоты, моно-, ди-, тритерпены, флавоноиды, алкалоиды, сапонины, кумарины, эфирные масла, дубильные вещества и витамины, которые и определяют их биологическую активность и ценность практического использования.

Была установлена антибактериальная, фунгицидная и антиоксидантная активности представителя семейства яснотковые - Salvia deserta, который может быть использован в качестве основы для разработки технологии получения биологически активных лекарственных средств, а также стать перспективным источником для создания антимикробных препаратов профилактического и лечебного характера отечественного производства.

Список литературы:

1. Миронова А.Н. Руководство: экспериментальное (доклиническое) изучение новых фармакологических веществ. - М.: Гриф и К,2012. - 944 с.
2. Павлова Л. А. Использование этномедицинских знаний в современном мире //Курортная база и природные лечебно-оздоровительные местности Тувы и сопредельных регионов. – 2015. – №. 2. – С. 23-27.
3. Паршина Г. Н., Курбатова Н. В. Изучение видов лекарственных растений из семейства Lamiaceae Lindl. при выращивании их в культуре //Вестн. КазНУ. – 2003. – №. 2. – С. 132-136.
4. Шретер А. И. (ред.). Правила сбора и сушки лекарственных растений:(Сборник. инструкций). – Медицина, 1985.
5.  Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standard //CLSI document M07-A9. – 2012. – Т. 32.
6.  Re R. et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay //Free radical biology and medicine. – 1999. – Т. 26. – №. 9-10. – С. 1231-1237.
7.  Satyajit D.S., Latif Z., Alexander I. Gray Natural Products Isolation // Human Press. - 2005. - 515р.
8.  Schofield C. B. Updating antimicrobial susceptibility testing methods //Clinical Laboratory Science. – 2012. – Т. 25. – №. 4. – С. 233.
9. Zhussupova A. et al. Immunomodulatory Effects of Plant Extracts from Salvia deserta Schang. and Salvia sclarea L //Plants. – 2022. – Т. 11. – №. 20. – С. 2690.