КОЛИ-ТИТР  И  ТИТР  КОЛИ-ФАГОВ  У  ПОРОСЯТ  С  ПОСТ-ОТЪЁМНЫМ  СИНДРОМОМ  НА  ФОНЕ  КОМБИНИРОВАНГНОГО  ПРИМЕНЕНИЯ  ФАГОВЫХ  И  ПРОБИОТИЧЕСКИХ  ПРЕПАРАТОВ

Скобликов  Николай  Эдуардович

кандидат  медицинских  наук,  Северо-Кавказский  научно-исследовательский  институт  животноводства  (СКНИИЖ),  г.  Краснодар,  заведующий  лабораторией  микробиологии

E-mail:  skoblikow@yandex.ru

Зимин  Андрей  Антонович

кандидат  биологических  наук,  Институт  биохимии  и  физиологии  микроорганизмов  им.  Г.  К.  Скрябина  (ИБФМ),  г.  Пущино  (Московская  обл.),  с.  н.  с.  лаборатории  молекулярной  микробиологии

E-mail:  zimin@ibpm.pushchino.ru

Работа  была  поддержана  грантом  РФФИ:  №  11-04-96575-р_юг_ц.

В  настоящее  время  существенные  ограничения  фаготерапии  различных  инфекций,  в  частности,  кишечных,  связаны  как  с  ограниченностью  представлений  о  взаимодействии  фаг-хозяйская  клетка  в  кишечнике,  так  и  со  способностью  фагов  трансдуцировать  различные  гены,  в  частности  –  детерминанты  устойчивости  к  антибиотикам.  Начиная  с  первой  работы  по  изучению  эффективности  применения  бактериофагов  в  лечении  эшерихиозной  диареи  свиней  [7,  P.  2659],  опубликовано  значительное  количество  исследований,  посвящённых  исследованиям  фаготерапии  инфекций,  вызванных  представителями  Escherichia  coli  [4,  P.  1400].  Несмотря  на  высокую  эффективность  бактериофагов  в  отношении  данной  группы  возбудителей  [1,  P.22],  на  пути  широкого  распространения  бактериофагов  возникает  ряд  проблем,  среди  которых  одной  из  самых  серьёзных  является  их  способность  к  трансдукции,  позволяющей  реализовывать  горизонтальный  перенос  генетических  детерминант  антибиотикорезистентности  [8,  P.  664]. 

В  медицине  важность  определения  трансдуцирующего  потенциала  фагов  [6,  P.  665]  признана  одним  из  критериев  отбора  эффективных  и  безопасных  бактериофагов  [5,  P.  225].  В  то  же  время,  несмотря  на  интенсивный  поиск  новых  средств  терапии  и  профилактики  инфекционных  заболеваний  [3,  P.  2917],  в  первую  очередь  таких,  как  эшерихиозная  диарея  свиней  [2,  P.  20],  изучение  фаговых  препаратов  на  основе  нетрансдуцирующих  бактериофагов  в  области  ветеринарии  до  последнего  времени  обойдено  вниманием.

Нами  проведено  исследование  терапевтического  влияния  микстуры  из  четырёх  нетрансдуцирующих  бактериофагов  E.  coli  (условные  лабораторные  номера:  №  6,  №  8,  №  9,  №  15),  а  также  их  комбинации  с  пробиотиком  на  основе  эндемичного  штамма  Lactobacillus  paracasei,  ранее  выделенного  от  поросят  этого  возраста  местной  популяции,  на  коли-титр  и  титр  коли-фагов  у  поросят  с  пост-отъёмным  синдромом.

Получение  препаративных  количеств  фагов  реализовывали  с  помощью  инкубации  (каждый  из  отобранных  фагов  инкубировался  изолированно)  на  культуре  лабораторного  штамма  E.coli  B;  фаги  были  сконцентрированы  методом  центифугирования,  в  результате  чего  были  получены  опытные  партии  экспериментальных  фаговых  препаратов  в  виде  взвеси  фаговых  частиц.  Концентрация  фагов  в  полученных  таким  образом  препаратах  колебалась  в  пределах  от  1,0×10⁹  до  1,4×10¹⁰  БОЕ/мл.

Параллельно  с  изучением  эффективности  традиционного  способа  применения  коли-бактериофагов  (per  os),  проверялось  предположение  о  системном  эффекте  бактериофагов  при  их  парентеральном  пути  введения.  Для  этого  были  сформированы  5  групп  животных  (по  18-20  голов  в  каждой  группе),  в  возрасте  28-29  дней;  животные  1-й  –  4-й  групп  получали  взвеси  фагов  №№  6,  8,  9,  15  (в  дозе  1,0×10⁹  БОЕ  на  голову  трёхкратно,  с  интервалом  три  дня)  соответственно;  животные  из  группы  №  5  (контрольной)  не  получали  фаговые  препараты  (схема  аналогична:  таблица  3).  Препарат  вводили  утром,  вскоре  после  кормления  (9⁰⁰  –  10⁰⁰)  с  помощью  безыгольного  инъектора  интракутанно  (внутрикожно)  в  область  основания  правого  уха.  Общий  период  наблюдения  за  животными  составил  13  дней.  В  течение  всего  периода  оценивались  данные  титра  E.  coli  и  титра  коли-фагов  в  фекалиях  поросят.

Также  было  исследовано  терапевтическое  влияние  микстуры  отобранных  фагов  (№№  6,  8,  9,  15),  а  также  их  комбинации  с  пробиотиком  (кисломолочная  закваска  на  основе  штамма  Lactobacillus  paracasei,  ранее  выделенного  от  поросят  этого  возраста  местной  популяции)  на  показатели  кишечного  микробиоценоза  свиней.  Для  этого  были  сформированы  6  групп  животных  (по  18-20  голов  в  каждой  группе),  в  возрасте  29-30  дней  с  клиникой  пост-отъёмного  синдрома.  Животные  1-й  и  3-й  групп  получали  микстуры  фагов  №№  6,  8,  9,  15  (в  дозе,  содержащей  по  2,5×10⁸  БОЕ  на  голову  трёхкратно,  с  интервалом  три  дня)  перорально;  животные  2-й  и  4-й  групп  получали  микстуры  фагов  интракутанно  в  область  основания  правого  уха;  животные  3-й,  4-й  и  5-й  групп  получали  пробиотический  препарат  (2,0×10¹¹  КОЕ  на  голову);  животные  6-й  группы  (контрольной)  получали  только  основной  рацион.  Общий  период  наблюдения  составил  13  дней.  В  течение  всего  периода  эффективность  фагового  препарата  оценивалась  по  лабораторным  данным  титра  E.coli  (коли-титра)  и  фагов  E.coli  (коли-фагов)  в  фекалиях  поросят.  Количество  E.coli  определяли  посевами  на  среду  Эндо  и  измеряли  в  колоние-образующих  единицах  (КОЕ),  обнаруживающихся  в  1  г  пробы. 

По  результатам  исследования  влияния  различных  способов  применения  микстуры  отобранных  фагов  (№№  6,  8,  9,  15),  а  также  их  комбинации  с  пробиотиком,  на  коли-титр  у  поросят  было  установлено,  что  пероральное  применение  фаговой  микстуры  корректирует  коли-титр  животных  в  большей  степени,  чем  интракутанное  введение.  Разница  между  показателями  у  животных  1-й  (получавших  фаги  per  os)  и  2-й  (получавших  фаги  внутрикожно)  групп  к  37-дневному  возрасту  составила  0,82  lg  КОЕ/г. 

Дополнительный  приём  пробиотика  оказывал  синергический  эффект  на  коррекцию  коли-титра  при  применении  фаговых  микстур  обоими  способами,  однако  более  выражено  –  при  пероральном  применении.  Так,  комбинированное  пероральное  применение  фагов  и  пробиотика  (3-я  группа)  демонстрировало  наибольшее  среди  всех  групп  снижение  коли-титра  к  37-дневному  (5,43  lg  КОЕ/г)  и  40-дневному  (5,85  lg  КОЕ/г)  возрасту.  Примечательно,  что  изолированное  применение  пробиотика  (5-я  группа),  оказывая  положительное  влияние  на  динамику  содержания  E.  coli  по  сравнению  с  контролем,  уступало  по  результатам  снижения  коли-титра  комбинированному  применению  фагов  и  пробиотика  (3-я  группа),  однако  незначительно  превосходило  изолированное  пероральное  применение  фагов  (1-я  группа)  в  возрасте  34-дней.  К  40-дневному  возрасту  различия  между  показателями  коли-титра  1-й  и  5-й  групп  составляли  менее  0,3  lg  КОЕ/г.

Проведённое  параллельно  исследование  содержание  коли-фагов  в  кишечнике  поросят  показало,  что  изолированное  внутрикожное  применение  фаговой  микстуры  практически  не  оказывает  влияния  на  динамику  коли-фагов  в  37-дневном  и  40-дневном  возрасте  (различия  с  контролем  недостоверны).  Пероральное  применение  фаговой  микстуры,  наоборот,  в  наибольшей  степени  способствовало  восстановлению  до-отъёмного  уровня  коли-фагов  (5,38  lg  БОЕ/г)  по  сравнению  с  контролем  (3,78  lg  БОЕ/г).

Изолированное  применение  пробиотика  (5-я  группа)  практически  не  корректировало  падение  титра  коли-фагов,  однако  способствовало  его  положительной  коррекции  при  применении  фаговой  микстуры;  причём,  при  интракутанном  применении  (4-я  группа)  –  в  большей  степени,  чем  при  пероральном  (3-я  группа). 

Таким  образом,  установлено,  что  наибольшее  влияние  на  коррекцию  динамики  содержания  E.  coli  оказывает  комбинированное  пероральное  применение  фаговой  микстуры  и  пробиотического  препарата.  Что  касается  динамики  титра  коли-фагов,  то  наибольшее  влияние  на  его  коррекцию  оказывает  не  только  комбинированное  применение  фаговой  микстуры  (причём  как  перорально,  так  и  интракутанно)  и  пробиотического  препарата,  но  и  изолированное  пероральное  применение  фаговой  микстуры.

Список  литературы:

1.Durham  S.,  Comis  D.,  Flores  A.  Subduing  Salmonella.  Several  strategies  seem  promising  //  Agricultural  Research.  2006.  10.  -  p.  22-26;

2.Fairbrother  J.  M.,  Nadeau  E.,  Gyles  C.  L.  Escherichia  coli  in  postweaning  diarrhea  in  pigs:  an  update  on  bacterial  types,  pathogenesis,  and  prevention  strategies  //  Anim  Health  Res  Rev.  2005;  6(1):  17-39;

3.Gill  J.  J.,  Pacan  J.  C.,  Carson  M.  E.  et  al.  Efficacy  and  Pharmacokinetics  of  Bacteriophage  Therapy  in  Treatment  of  Subclinical  Staphylococcus  aureus  Mastitis  in  Lactating  Dairy  Cattle  //  Antimicrobial  Agents  And  Chemotherapy,  2006,  Vol.  50,  No.  9.  p.  2912–2918;

4.Huff  W.  E.,  Huff  G.  R.,  Rath  N.  C.  et  al.  Bacteriophage  Treatment  of  a  Severe  Escherichia  coli  Respiratory  Infection  in  Broiler  Chickens  //  Avian  Diseases,  2003,  Vol.  47,  No.  4  ,  pp.  1399-1405;

5.Masatoshi  Yoichi,  Masatomo  Morita,  Katsunori  Mizoguchi  et  al.  The  criterion  for  selecting  effective  phage  for  Escherichia  coli  O157:H7  control  //  Biochem.  Engineering  J.  2004.  Vol.  №  19,  pp.  221-227.

6.Saunders  J.  R.,  Allison  H.,  James  C.  E.  et  al.  Phage-mediated  transfer  of  virulence  genes  //  J.  Chem.  Technol.  Biotechnol.  2001.  76:662–666;

7.Smith  H.W.,  Huggins  M.B.  Effectiveness  in  Treating  Experimental  Escherichia  coli  Diarrhea  in  Calves,  Piglets  and  Lambs  //  Journal  of  General  Microbiology.  1983.  Vol.  129  :  2659-2669;

8.Zhang  X.,  McDaniel  A.  D.,  Wolf  L.  E.  et  al.  Quinolone  antibiotics  induce  Shiga  toxin-encoding  bacteriophages,  toxin  production,  and  death  in  mice  //  J  Infect  Dis.  2000;181:664–670.