Бактерии  рода  Bacillus  как  агенты  биологического  контроля  фитопатогенов  картофеля

Воронкович  Наталья  Викторовна

м.  н.  с.  Института  микробиологии  НАН  Беларуси,  г.  Минск

E-mail: 

Ананьева  Ирина  Николаевна

к.  б.  н,  с.  н.  с.  Института  микробиологии  НАН  Беларуси,  г.  Минск, 

E-mail: 

Коломиец  Эмилия  Ивановна

директор  Института  микробиологии  НАН  Беларуси,  член-корр.,  д.  б.  н.,  г.  Минск 

E-mail: 

Исследования  по  биологической  защите  картофеля  от  болезней  в  периоды  вегетации  и  хранения  чрезвычайно  актуальны,  поскольку  ущерб,  причиняемый  патогенными  микроорганизмами,  приводит  к  значительным  потерям  урожая  этой  ценной  сельскохозяйственной  культуры,  широко  используемой  в  пищевых  и  кормовых  целях,  а  также  в  качестве  сырья  для  перерабатывающей  промышленности.  В  последние  годы  отмечается  увеличение  вредоносности  таких  хорошо  известных  заболеваний  картофеля  как  фитофтороз,  альтернариоз,  парша,  черная  ножка.  Участились  случаи  появления  кольцевой  гнили  –  особенно  опасного  бактериального  заболевания  картофеля  [2]. 

На  сегодняшний  день  в  мире  накоплен  определенный  опыт  по  использованию  микроорганизмов-антагонистов  для  защиты  картофеля  от  болезней.  Бактерии  pода  Васillus,  обладающие  широким  спектром  антагонистической  активности  [1],  относятся  к  числу  наиболее  перспективных  агентов  биологического  контроля  патогенов  картофеля.  Продуцируемые  ими  метаболиты  преимущественно  представлены  антибиотиками  полипептидного  и  аминогликозидного  ряда,  которые  подавляют  рост  и  развитие  целого  ряда  патогенов  сельскохозяйственных  культур.  Важной  особенностью  бактерий  рода  Bacillus  как  основы  биопестицидов  является  также  устойчивость  к  неблагоприятным  условиям  внешней  среды  за  счет  способности  к  спорообразованию.

С  учетом  вышеизложенного  проведено  выделение  и  скрининг  бактерий  рода  Bacillus  с  высокой  антагонистической  активностью  к  патогенам  картофеля.  Для  выявления  активных  антагонистов  использовали  метод  точечного  тестирования  и  метод  лунок.  Тест-объектами  служили  штаммы  Phytophthora  infestan,  Fusarium  oxysporum,  Colletotrichum  coccodes  ,  Rhizoctonia  solani  и  Pectobacterium  atrosepticum  -  возбудители  фитофтороза,  фузариоза,  антракноза,  ризоктониоза  и  черной  ножки  картофеля  соотвественно. 

Из  972  выделенных  изолятов  36  (около  4  %  от  общего  количества)  обладали  способностью  в  той  или  иной  степени  подавлять  развитие  испытанных  фитопатогенных  микроорганизмов.  Наиболее  высокой  антагонистической  активностью  характеризовался  изолят  17,  отобранный  нами  для  дальнейших  исследований.  Результаты  культурально-морфологических  и  физиолого-биохимических  тестов  позволили  отнести  выделенные  бактерии  к  виду  Bacillus  subtilis  [3]. 

В  последующих  экспериментах  оценены  особенности  биотических  взаимоотношений  выделенной  культуры  с  фитопатогенными  грибами  F.oxysporum,  F.solani  и  F.  sambucinum.  Для  изучения  влияния  бактериального  экссудата  на  прорастание  грибных  конидий  бактерии  культивировали  в  колбах  с  50  мл  среды  Мейнелла  в  течение  24  ч  при  28⁰C  на  качалке.  Затем  проводили  центрифугирование  (10  мин,  4800g)  20  мл  культуральной  жидкости  с  последующим  шприцевым  фильтрованием  фугата  (диаметр  пор  0,20µm).  В  пробирки  Эппендорфа  (1,5  мл)  помещали  по  1  мл  полученного  фильтрата  и  по  0,5  мл  суспензии  спор  гриба  (5∙10⁴).  В  качестве  контроля  вместо  фильтрата  вносили  1  мл  стерильной  среды  Мейнелла.  Пробирки  затем  инкубировали  в  темном  помещении  на  качалке  в  течение  24  ч  при  28⁰C. 

Для  оценки  фунгитоксичных  свойств  бактериального  фильтрата,  конидии  осаждали  центрифугированием  (3200об/мин,  5  мин),  трижды  промывали  стерильной  средой  Мейнелла  и  инкубировали  еще  48  ч  в  тех  же  условиях.  Степень  прорастания  конидий  оценивали  под  микроскопом.  Конидия  считалась  проросшей,  если  длина  проростка  была  не  менее  1,5  длины  самой  конидии.  Ингибирование  прорастания  конидий  рассчитывали  следующим  образом:  [(число  проросших  конидий  в  контроле  –  число  проросших  конидий  в  фильтрате)  /  число  проросших  конидий  в  контроле]×100  %.  Подсчет  клеток  осуществляли  с  помощью  камеры  Горяева  [5]. 

Результаты  данного  эксперимента  показали,  что  метаболиты  B.subtilis  17  ингибируют  прорастание  конидий  F.  oxysporum,  F.  sambucinum  и  F.  solani  на  83,  77  и  74  %,  соответственно  (рисунок  1). 

Рисунок  1.  Влияние  бесклеточного  фильтрата  B.subtilis  17  на  прорастание  конидий  F.oxysporum:  1  -  контроль,  2  –  опыт  (после  воздействия  B.subtilis  17)

Способность  штамма  Bacillus  subtilis  17  продуцировать  метаболиты,  ингибирующие  рост  грибов  рода  Fusarium,  подтверждена  также  методом  агаровых  пластинок.  Для  этого  агаровую  пластинку  (диск  диаметром  8  мм)  с  активно  растущим  мицелием  гриба  помещали  в  центр  чашки  Петри  (90  мм)  на  картофельно-глюкозную  агаризованную  среду.  Бактериальную  культуру  засевали  штрихом  на  всю  поверхность  среды  в  чашке  на  расстоянии  2  см  от  пластинки.  Чашки  инкубировали  при  24⁰С  в  течение  примерно  5  суток  (пока  мицелий  в  контроле  не  достигал  края  чашки).  Измеряли  радиальный  рост  грибного  мицелия  и  оценивали  степень  его  ингибирования  в  сравнении  с  контролем  по  формуле:  [(радиус  свободного  роста  колонии  -  радиус  колонии  в  направлении  роста  бактерии)  /  радиус  свободного  роста  колонии]•100  %  (таблица  1)  [4]. 

Таблица  1.  Влияние  метаболитов  B.subtilis  17  на  рост  мицелия  F.  oxysporum,  F.sambucinum  и  F.solani

Кроме  того,  в  ходе  данного  эксперимента  были  обнаружены  изменения  морфологии  мицелия  гриба:  гифы  приобретали  волнистую  форму,  на  них  образовывались  шарообразные  вздутия,  что  было  особенно  выражено  при  воздействии  бактериальных  метаболитов  на  мицелий  F.oxysporum  (таблица  2).  Полученные  данные  позволяют  сделать  вывод,  что  изменения  в  морфологии  и  росте  грибов  ведут  к  нарушению  их  нормального  цикла  развития,  что  согласуется  с  результатами,  полученными  методом  точечного  тестирования  и  методом  лунок. 

Таблица  2.  Изменения  морфологии  мицелия  F.  oxysporum,  F.sambucinum  и  F.solani  под  воздействием  метаболитов  B.subtilis  17

Результаты  исследований  показали,  что  штамм  B.  subtilis  17  проявляет  антифунгальную  активность  в  отношении  грибов  рода  Fusarium,  выраженную  в  замедлении  скорости  роста  и  изменении  морфологии  мицелия,  а  также  в  ингибировании  прорастания  конидий.  Данные  свойства  штамма  определяют  перспективность  его  использования  для  разработки  биологического  средства  защиты  картофеля  от  болезней  грибной  этиологии. 

Список  литературы:

1.Антифунгальные  и  фитостимулирующие  свойства  ризосферного  штамма  Bacillus  subtilis  Ч-13  -  продуцента  биопрепаратов  //  B.  К.  Чеботарь  и  др.  /  Прикладная  биохимия  и  микробиология,  2009.  -  Т.  45,  №  4.  -  с.  465–469. 

2.Защита  картофеля  от  болезней,  вредителей  и  сорняков  //  Иванюк  В.  Г.  и  д.р.  –  Мн.:  РУП  «Белорусский  НИИ  картофелеводства»,  2003.  –  550  с. 

3.Bergey's  manual  of  systematic  bacteriology  /S.  T.  Williams  et.  al.  –  Baltimore  :  Williams  and  Wilkins,  1989.  –  Vol.  4.  –  2545  p.

4.Endophytic  bacterial  flora  in  root  and  stem  tissues  of  black  pepper  (Piper  nigrum  L.)  genotype:  isolation,  identification  and  evaluation  against  Phytophthora  capsici  /  Aravind  R.  et  al.  -  Letters  in  Applied  Microbiology,  2009.  -  Vol.  48(1).  –  P.  58–64. 

5.The  role  of  antibiosis  in  the  antagonism  of  different  bacteria  towards  Helminthosporium  solani,  the  causal  agent  of  potato  silver  scurf  /  C.Martinez  et  al.  -  Phytoprotection,  2006.  -  Vol.  87.  -  P.  69–75.