ИЗУЧЕНИЕ ДИНАМИКИ НАКОПЛЕНИЯ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ В ДИКОРАСТУЩИХ ЯГОДАХ КЛЮКВЫ (OXYCOCCUS PALUSTRIS) МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Лютикова Марина Николаевна

аспирант, СурГУ, г. Сургут

e-mail:

Туров Юрий Прокопьевич

канд. физ.-мат. наук, доцент, СурГУ, г. Сургут

e-mail:

Витамин С – общепризнанный антиоксидант, значение которого для организма сложно переоценить. Аскорбиновая кислота принимает участие в непрерывно происходящих в живой клетке окислительно-восстановительных процессах, и её рассматривают как мощный стимулирующий фактор для укрепления иммунной системы, повышающий устойчивость организма к агрессивному воздействию окружающей среды.

История открытия аскорбиновой кислоты уходит далеко в прошлое, но даже сегодня не прекращается полемика о значении витамина С для здоровья человека, об оптимальных дозах витамина, которые следует принимать, поскольку в процессе эволюции человек утратил способность синтезировать аскорбиновую кислоту в организме. Его роль в лечении простудных заболеваний, в улучшении состояния раковых больных и другие медицинские аспекты являются темами оживленных дискуссий [3].

L-Аскорбиновая кислота обнаружена в организмах многих животных и у всех представителей растительного мира, во всех частях растений, и часто в больших количествах. Рассматривая любой растительный продукт, человек оценивает его компонентный состав с точки зрения полезного действия на физиологическое состояние своего организма. Несмотря на это, любое растение синтезирует вещества, прежде всего, в своих целях. Так, аскорбиновая кислота, обладая способностью обратимо окисляться и восстанавливаться, принимает участие в важнейших энергетических процессах растительной клетке – фотосинтезе и дыхании; является признанным антиоксидантом. Несомненно, её участие в процессах роста, цветения, вегетативной и репродуктивной дифференциации, в водном обмене, регуляции ферментативной активности, стимуляции реакций метаболизма, связанных с обменом нуклеиновых кислот и синтезом белка, в защитных реакциях растений [3, 7].

Литературные данные об уровне накопления витамина С в ягодах клюквы болотной носят довольно противоречивый характер. По одним данным концентрация витамина С по мере созревания ягод увеличивается и достигает максимального значения в полузрелом состоянии [2, 8], по другим – наибольшая его концентрация отмечается в зеленых ягодах [4]. Количество аскорбиновой кислоты в зрелой клюкве по разным источникам варьирует в широких пределах от 10 до 80 мг/100 г сырого веса ягод [1, 2, 4, 5, 8].

Широкий диапазон колебания концентрации аскорбиновой кислоты в ягодах вероятно связан не только с экологическими условиями их произрастания, но и в большей степени обусловлено тем многообразием методических приемов, которые используются разными исследователя при определении витамина С в биообъектах.

Цель наших исследований включала изучение накопления аскорбиновой кислоты в плодах дикорастущей клюквы болотной, произрастающей на одной территории с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Объектом исследования послужили ягоды дикорастущей клюквы собранной в Сургутском районе (окрестности г. Когалым), который расположен на территории Ханты-Мансийского автономного округа. Сбор ягод производился в нескольких степенях зрелости: незрелая – конец июля (зеленая окраска), полузрелая – начало сентября (розовая окраска), зрелая – начало октября (темно-красная окраска), перезрелая – конец октября (бордовая окраска).

Таблица 1. Информация о времени сбора и степени зрелости Oxycoccus palustris

Хроматографическое измерение концентрации аскорбиновой кислоты проводили на жидкостном хроматографе "Милихром А-02" с многоволновым УФ-детектором на колонке с обращенной фазой ProntoSIL-120-5-C18 AQ DB-2003 (диаметр колонки 2 мм, длина 75 мм, размер частиц 5 мкм). Подвижная фаза: элюент А - 4M LiClO4+0.1M HClO4, элюент Б – вода; градиентный режим элюирования: 40 мин от 5 до 100 % элюента Б, 3 мин 100 % элюента Б; перед вводом пробы колонку промывают 0,8 мл подвижной фазы состава "элюент А":"элюент Б" - 95:5 (кондиционирование колонки); скорость потока: 100 мкл/мин; детектирование: многоволновой однолучевой режим детектирования при длинах волн 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 и 300 нм с постоянной времени 0,18 сек; температура термостатирования колонки: (21±0,3)°С; объем вводимой пробы 5 мкл. Условия хроматографирования были подобраны экспериментально.

Концентрацию витамина С в ягодах рассчитывали по методу абсолютной градуировки. Для построения градуированной зависимости готовили серию растворов аскорбиновой кислоты в диапазоне 10—100 мг/дм³, путем разбавления нужного количества основного раствора концентрацией 300 мг/дм³. Основной раствор готовили растворением навески аскорбиновой кислоты 0,03 г в бидистиллированной воде в мерной колбе емкостью 100 см³. Градуировочные растворы 10,0; 20,0; 30,0; 50,0; 75,0; 90,0 и 100,0 мг/дм³ готовили в мерной колбе объемом 50 см³.

Анализ и подготовку проб проводили на следующий день после сбора ягод непосредственно перед измерениями. 5 г гомогенизированной смеси ягод переносили в мерную колбу и доводили бидистиллированной водой в мерной колбе на 50 см³. После этого, тщательно перемешав, отобрали 10 см³ пробы и поместили в центрифужные пробирки для отделения взвешенных частиц. Центрицугирование проводили в течение 10 мин при 7400 об/мин. Надосадочную жидкость отбирали для анализа.

Хроматографирование каждого из растворов проводили в условиях, описанных выше.

Идентификацию аскорбиновой кислоты в анализируемом образце проводили по времени удерживания обнаруженной в экстракте примеси и спектральным отношениям при семи длинах волн.

На рис. 1 и 2 представлены хроматограммы стандартного раствора аскорбиновой кислоты и исследуемых образцов ягод клюквы (например: сбор 3) соответственно.

Рисунок 1. Хроматограмма стандартного раствора аскорбиновой кислоты.

Рисунок 2. Хроматограмма экстракта ягод клюквы (Сургутский район, сбор 3).

Время удерживания стандартного образца аскорбиновой кислоты совпадает с временем удерживания обнаруженных в экстрактах примесей (пик на рис. 1. и пик 1 на рис. 2.), это позволило сделать предположение, что они соответствуют аскорбиновой кислоте.

Таблица 2. Сравнение спектральных отношений стандартного раствора аскорбиновой кислоты и пика из экстракта ягод клюквы (сбор 3)

Примечание: АК – аскорбиновая кислота.

Сравнивая спектральные отношения аскорбиновой кислоты и пика примеси из анализируемого экстракта, следует отметить их полное соответствие (табл. 2.). Кроме того, полученные спектральные параметры стандартных растворов аскорбиновой кислоты совпадают с табличными данными, приведенные в БД-2003-250 [6].

Полученные хроматограммы обрабатывали с помощью программы МультиХром (обработка данных), и был построен градуировочный график. СКО при этом составило 1,3 % (рис. 3). Градуировочный коэффициент 0,02319.

Рисунок 3. Градуировочный график для определения аскорбиновой кислоты.

Проверка воспроизводимости результатов.

Для воспроизводимости результатов провели по 7 опытов с каждым из образцов.

Для ягод клюквы сбора 1—4 получили следующие результаты (Таблица 2).

Таблица 2. Математическая обработка результатов анализа

1)  Проверка по Q критерию проводится по следующим уравнениям:

Q(P_дов=0.95, n=7)=0.51

Q₁=(X₂-X₁)/(X_n-X₁)<0.51

Q_n =(X_n-X_n-1)/(X_n-X₁)<0.51

По Q критерию все результаты относятся к одной совокупности (табл.2).

2)  Среднее отклонение единичного измерения (среднеквадратичное отклонение):

3)  Коэффициент Стьюдента t (P_дов=0.95, n=7)= 2.36

Погрешность определения аскорбиновой кислоты составила не более 3,13 %.

Полученные результаты исследования показывают, что наибольшее содержание витамина С в дикорастущей клюкве в начале сентября-октябре, в фазе розовой (34,70±0,33 мг/100 г сырого веса) и темно-красной (36,52±0,28 мг/100 г сырого веса) окраски плодов, до наступления заморозков (30,29±0,34 мг/100 г сырого веса).

Список литературы:

1.            Авилова С. В., Иванова С. В. Купажирование натуральных соков с использованием черники, брусники и клюквы // Известия ТСХА. — Вып.2. — 2005. — С. 59—67.

2.            Баранова И. И. К состоянию изученности пищевой и лекарственной ценности некоторых дикорастущих ягод Карелии // Комплексные исследования растительности болот Карелии. Петрозаводск: Карельский фил. АН СССР, 1982. — С. 156—166.

3.            Девис М., Остин Дж., Патридж Д. Витамин С: Химия и биохимия: Пер. с англ. М.: Мир,1999. — 176 с.

4.            Кузнецова Н. А. Пищевая ценность соков из дикорастущих ягод клюквы и черники. М., 1975. — 33 с.

5.            Сенчук Г.В. Биохимические свойства и сохраняемость дикорастущих ягод Белоруссии: Автореферат. диссерт. на соиск. уч.степ .кандидата технических наук: 05.18.15 / Г. В. Сенчук — Москва, 1973. — 21 с.

6.            Хроматографические и спектральные параметры УФ-поглощающих веществ. Методика выполнения измерений методом высокоэффективной хроматографии. Иркутск: РАН. Сибирское отделение лимнологический институт, 2003. — С. 32—64.

7.            Чупахина Г.Н. Система аскорбиновой кислоты растений: Монография. Калининград: Калинингр. Ун-т., 1997. — 120 с. — ISBN 5-88874-063-2.

8.            Borowska I. Antioxidant Activity of Berry Fruits and Beverages/I. Borowska, A. Szajdek//Pol. J. Natur. Sc. — 2003. — № 14. — P. 521—528.