ТЕХНОЛОГИЧНЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОРИНОВЫХ БЕЛКОВ ИЗ НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ YERSINIA RUCKERI, ПАТОГЕННОЙ ДЛЯ РЫБ

Чистюлин Дмитрий Константинович

аспирант, ТИБОХ ДВОРАН, г. Владивосток

E-mail: cdk27@mail.ru

Мензорова Наталья Ильинична

канд. хим. наук, ст. науч. сотр., ТИБОХ ДВОРАН, г. Владивосток

E-mail:

Новикова Ольга Данииловна

д-р. хим. наук, ст. науч. сотр., ТИБОХ ДВОРАН, г. Владивосток

Ким Наталья Юрьевна

науч. сотр., ТИБОХ ДВОРАН

E-mail:

Yersinia ruckeri – грамотрицательная бактерия, вызывающая у рыб иерсиниоз, который поражает, в основном, представителей семейства лососевых: развивается заражение крови и возникают кровоизлияния на поверхности тела и внутренних органов [6]. Ежегодно Y. ruckeri является причиной больших экономических потерь в индустрии аквакультур [4]. Несмотря на значимость проблемы, пока мало известно о механизмах патогенеза заболевания и иммунодоминантных антигенах возбудителя, что препятствует разработке превентивных мер для эффективной борьбы с этим инфекционным заболеванием.

В то же время, известно, что неспецифические порообразующие белки, служащие для транспорта низкомолекулярных веществ через мембрану бактерий, OmpF и OmpC порины, являются высоко иммуногенными антигенами наружной мембраны (НМ) патогенных для человека иерсиний. Они могут быть использованы как эффективные компоненты при конструировании вакцинных препаратов [2]. Недавно с помощью классического способа получения порообразующих белков [5] из НМ Y. ruckeri нами был выделен OmpF порин (молекулярная масса 38 кДа), охарактеризованы его физико-химические свойства и функциональная активность [3]. Однако для наработки препаративных количеств белка необходим более простой способ его получения.

В данной работе представлены результаты по разработке упрощенного метода получения OmpF порина из Y. ruckeri. Метод является технологичным, так как были исключены стадии дезинтеграции микробных клеток и очистки от низкомолекулярных белков с помощью гель-проникающей хроматографии. Метод основан на устойчивости тримеров поринов к действию протеиназ. Для получения очищенной фракции поринов был использован ферментативный препарат из гепатопанкреаса промысловых видов крабов [1], содержащий помимо ДНК-зы ряд протеолитических ферментов. Это позволило в одну стадию очистить сырую фракцию пориновых белков от нуклеиновых кислот и примесных низкомолекулярных белков (рис. 1 и 2). Следует особо подчеркнуть, что в данном случае мы обрабатывали ферментативным препаратом раствор порина (полученный после диссоциации комплекса пептидогликан-пориновые белки) с последующим осаждением белка ацетоном, в то время как согласно классическому способу получения поринов из НМ грамотрицательных бактерий стадия очистки от нуклеиновых кислот предшествует диссоциации комплекса пептидоглкан-пориновые белки.

Рис.1. Спектры поглощения сырой (1) и очищенной (2) фракции пориновых белков из Y. ruckeri.

Рисунок. 2. Электрофореграмма фракций пориновых белков, ассоциированных с пептидогликаном из Y. ruckeri:

1-неочищенная фракция тримеров поринов, полученная классическим методом по Розенбушу;

2-фракция 1 после кипячения образца;

3-очищенная ДНКазой из гепатопанкреаса краба фракция 1 (тримеры порина);

4-фракция 3 после кипячения (мономеры порина)

На рис. 1 приведены УФ – спектры фракций пориновых белков, сырой и очищенной с помощью ферментативного препарата из гепатопанкреаса промысловых видов крабов. Как видно из данных рисунка, исходная белковая фракция, помимо полосы поглощения при 278 нм, имеет полосу поглощения нуклеиновых кислот. После обработки ферментативным препаратом (рис. 1 А) в спектре OmpF порина из Y. ruckeri наблюдается только полоса поглощения белка.

На рис. 2 приведены электрофореграммы фракций пориновых белков, ассоциированных с пептидогликаном из Y. ruckeri. Как видно из данных рисунка, изолированные тримеры порина, обработанные ферментативным препаратом из гепатопанкреаса промысловых видов крабов не содержат примеси низкомолекулярных белков. Гомегенность полученного препарата OmpF порина из Y. ruckeri была подтверждена установлением аминокислотной последовательности N-концевого фрагмента молекулы белка: она совпадала с N-концевой последовательностью белка, выведенной из соответствующей нуклеотидной последовательности [3].

Как было показано ранее с помощью SDS, ПААГ-электрофореза [3], OmpF порин из Y. ruckeri очень устойчив к действию температуры, диссоциация тримеров на мономеры происходит между 80 и 85^оС. Как правило, необратимый конформационный переход, сопровождающий диссоциацию тримеров неспецифических поринов грамотрицательных бактерий на мономеры [3] происходит в интервале температур 50—70 С^о . Таким образом, высокотемпературный конформационный переход OmpF порина из Y. ruckeri наблюдается для поринов грамотрицательных бактерий впервые. Полученные с помощью SDS, ПААГ-электрофореза данные были подтверждены методом собственной белковой флуоресценции. На рис. 3 зависимость интенсивности флуоресценции OmpF порина из Y. ruckeri при максимальной длине волны от температуры. Как видно из данных рисунка, температура перехода порина в денатурированный мономер приходится на 82.5^оС (середина S-образной кривой приведенной зависимости).

На рисунке 4 приведены суммарные (λ_возб. 280 нм) спектры флуоресценции тримеров и денатурированных мономеров OmpF порина из Y. ruckeri. Как видно из данных рисунка, термоденатурация порина приводит к смещению максимума эмиссии белка в коротковолновую область спектра на 10 нм. Это явление, так называемого «голубого» сдвига характерно для всех неспецифицических поринов грамотрицательных бактерий [3, 5].

Рис. 3. Зависимость интенсивности флуоресценции OmpF порина из Y. ruckeri при максимальной длине волны от температуры.

Рис. 4. Спектры флуоресценции изолированных тримеров (1) и денатурированных мономеров (2) OmpF порина из Y. ruckeri

Таким образом, разработанная нами модификация способа выделения поринов из НМ грамотрицательных бактерий открывает возможность получения высокоочищенных пориновых белков и в тех случаях, когда связь поринов с пептидогликаном не достаточно прочна и требуется дополнительная очистка фракции пориновых белков от нуклеиновых кислот.

Список литературы:

1.Артюков А.А., Мензорова Н.И., Козловская Э.П., Кофанова Н.Н., Козловский А.С., Рассказов В.А. Патент на изобретение № 2280076 от 20.07.2006, РФ. Ферментный препарат из гепатопанкреаса промысловых видов крабов и способ его получения.

2.Портнягина О.Ю., Новикова О.Д., Вострикова О.П., Хоменко В.А., Соловьева Т.Ф. Бактериальные порины как перспективные антигены для диагностики и вакцинопрофилактики инфекционных заболеваний // Вестник ДВО РАН. 2004. № 3. С. 35—44.

3.Чистюлин Д.К., Новикова О.Д., Хоменко В.А., Портнягина О.Ю., Вакорина Т.И., Ким Н.Ю., Исаева М.П., Лихацкая Г.Н., Соловьева Т.Ф. Выделение и характеристика OmpF-подобного порина наружной мембраны Yersinia ruckeri. // Биол.мембр. 2012. № 29(3), C. 156—164.

4.Bullock G.L., Stuckkey H.M., Shotts E.B. Enteric redmouth bacterium: comparison of isolates from different geographic areas. // J. Fish Dis.1978. № 1, P. 351–356.

5.Rosenbusch J.P. Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding. // J. Biol. Chem. 1974. V. 249. № 24. P. 8019—8029.

6.Rucker R. Redmouth disease of Rainbow trout (Salmo gairdneri). // Bull. Office Intern. Epizootes. 1966. № 65, P. 825–830.