ВЛИЯНИЕ  НИЗКОИНТЕНСИВНОГО  КРАСНОГО  СВЕТА  НА  СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОЕ  ОКИСЛЕНИЕ  ПОСЛЕ  ОБЛУЧЕНИЯ  МОЩНЫМ  ЛАЗЕРОМ

Баврина  Анна  Петровна

канд.  биол.  наук,  доцент  кафедры  медицинской  физики  Нижегородской  государственной  медицинской  академии,  г.  Нижний  Новгород

E-mail:  annabavr@rambler.ru

Монич  Виктор  Анатольевич

д-р  биол.  наук,  зав.  кафедрой  медицинской  физики  Нижегородской  государственной  медицинской  академии,  г.  Нижний  Новгород

Малиновская  Светлана  Львовна

д-р  биол.  наук,  профессор  кафедры  медицинской  физики  Нижегородской  государственной  медицинской  академии,  г.  Нижний  Новгород

Борзиков  Владимир  Владимирович

аспирант  кафедры  физиологии  и  биохимии  человека  и  животных  Нижегородского  государственного  университета,

г.  Нижний  Новгород

Кононов  Александр  Дмитриевич

студент  Нижегородской  государственной  медицинской  академии,

г.  Нижний  Новгород

Котельникова  Анастасия  Олеговна

студент  Нижегородской  государственной  медицинской  академии,

г.  Нижний  Новгород

THE  IMPACT  OF  LOW-INTENSI  LIGHT  ON  THE  FREE-RADICAL  OXIDATION  AFTER  EXPOSURE  TO  A  POWERFUL  LASER

Bavrina  Anna

candidate  of  Science,  assistant  professor  of  medical  physics  department  of  Nizhny  Novgorod  State  Medical  Academy,  Nizhny  Novgorod

Monich  Victor

doctor  of  Science,  professor,  head  of  medical  physics  department  of  Nizhny  Novgorod  State  Medical  Academy,  Nizhny  Novgorod

Malinovskaya  Svetlana

doctor  of  Science,  professor  of  medical  physics  department  of  NNSMA,  Nizhny  Novgorod

Borsikov  Vladimir

graduate  student  of  physiology  and  biochemistry  of  the  human  and  animal  department  of  Lobachevsky  State  University,  Nizhny  Novgorod

Kononov  Aleksandr

student  of  Nizhny  Novgorod  State  Medical  Academy,  Nizhny  Novgorod

Kotelnikova  Anastasia

student  of  Nizhny  Novgorod  State  Medical  Academy,  Nizhny  Novgorod

АННОТАЦИЯ

При  исследовании  глутатион-S-трансферазы  и  продуктов  окислительной  модификации  белков  в  сыворотке  крови  и  мышечной  ткани  крыс  после  воздействия  мощным  лазером  обнаружено  уменьшение  активности  фермента  и  увеличение  количества  продуктов  окислительной  модификации  белков.  При  последующем  воздействии  широкополосным  красным  светом  выявлено  увеличение  активности  глутатион-S-трансферазы  и  снижение  уровня  продуктов  окисления.  Сделан  вывод,  что  широкополосный  свет  данного  спектра  и  интенсивности  вызывает  корректирующее  действие,  направленное  на  нормализацию  активности  антиоксидантной  системы. 

ABSTRACT

An  decrease  of  glutathione-S-transferase  activity  and  increase  of  quantity  of  products  of  protein  oxidative  modification  in  blood  serum  and  muscle  tissue  of  rats  after  exposure  to  powerful  laser  has  been  detected.  An  increase  of  glutathione-S-transferase  activity  and  decrease  of  level  of  products  of  oxidation  after  subsequent  exposure  to  broadband  red  light  has  been  discovered.  It  has  been  concluded  that  broadband  light  caused  corrective  action  aimed  at  normalization  the  activity  of  antioxidant  system.

Ключевые  слова:  окислительная  модификация  белков;  глутатион-S-трансфераза;  красный  свет;  лазер.

Keywords:  protein  oxidative  modification;  glutathione-S-transferase;  red  light;  laser.

В  связи  с  технологическим  прогрессом,  во  многих  областях  науки  и  практической  медицины,  проводится  внедрение  инновационных  методов  и  инструментов,  таких  как  применение  лазеров.  Свойства  лазерного  излучения  позволили  широко  его  применять  в  различных  областях:  хирургии,  терапии  и  диагностике.  Клинические  исследования  показали  эффективность  воздействия  на  патологический  очаг  и  на  весь  организм  в  целом  лазеров  ультрафиолетового,  видимого  и  инфракрасного  спектров.

Одно  из  свойств  лазерного  облучения  —  резкая  зависимость  величины  и  даже  знака  эффекта  от  дозы  облучения  и  функционального  состояния  биологического  объекта,  будь  то  изолированные  клетки,  ферментные  системы  или  организм  человека  в  целом.  Позитивное,  стимулирующее  действие  излучения  проявляется,  как  правило,  в  узком  интервале  интенсивностей,  а  затем  исчезает  или  даже  сменяется  угнетающим  действием.  Это  справедливо  рассматривается  как  указание  на  несколько  разных  механизмов  действия  лазерного  света.  Мощный  лазерный  луч,  попадающий  на  биологические  ткани,  может  вызвать  серьезные  поражения,  такие  как  нарушения  в  деятельности  ЦНС,  сердечно-сосудистой  системы,  эндокринных  желез,  сворачивание  или  распад  крови,  повреждение  глаз,  кожи,  генетические  изменения,  головную  боль,  расстройства  сна,  слабость  [3].

В  связи  с  этим  актуальной  задачей  является  поиск  терапевтических  и  лечебных  средств,  направленных  на  снижение  сверхтерапевтического  воздействия  на  органы  и  ткани  организма.

Одним  из  наиболее  важных  показателей  состояния  организма  в  норме  и  при  патологии  является  уровень  продуктов  свободнорадикального  окисления  и  ферментов  антиоксидантной  защитной  системы.  Для  оценки  данных  показателей  проводятся  исследования  активности  антиоксидантных  ферментов,  а  также  содержания  продуктов  перекисного  окисления  липидов  и  белков.  Одним  из  самых  распространенных  ферментов,  использующихся  для  оценки  активности  антиоксидантной  системы  организма,  является  глутатион-S-трансфераза  (ГSТ),  которая  обнаружена  практически  во  всех  животных  клетках  и  катализирует  большое  количество  реакций. 

Также  известно,  что  широкополосный  красный  свет  видимого  спектра  обладает  способностью  реактивировать  антиоксидантные  ферменты  и  в  связи  с  этим  снижает  продукцию  активных  форм  кислорода,  повреждающих  различные  структуры  клетки  при  негативном  воздействии  на  организм  [2].

Цель  исследования:  изучение  влияния  широкополосного  красного  света  на  свободно-радикальное  окисление  в  сыворотке  крови  и  мышечных  тканях  крыс  после  облучения  мощным  лазером  видимого  спектра. 

Материалы  и  методы.  Исследования  проводились  на  беспородных  белых  крысах  массой  180—250  грамм,  которые  были  разделены  на  3  группы.  Первую  группу  (контроль)  составили  10  крыс,  получивших  локальное  сверхтерапевтическое  облучение  внутренней  поверхности  бедра  мощным  лазером  видимого  спектра.  Облучение  проводилось  лазером  с  длиной  волны  671  нм  и  выходной  мощностью  50  мВт.  Интенсивность  лазера  в  месте  светового  пятна  составила  0,55  Вт/см².  Вторую  группу  (опыт)  составили  10  крыс,  также  получивших  локальное  облучение  внутренней  поверхности  бедра  лазером,  но  впоследствии  та  же  область  бедра  ежедневно  (в  течение  3  дней)  облучалась  низкоинтенсивным  красным  светом  в  течение  20  минут.  Интенсивность  широкополосного  света  в  зоне  светового  пятна  составила  5  мВт/см².  В  эксперименте  использовался  свет  сверх  яркого  светодиода  с  максимумом  спектрального  диапазона  630  нм  и  шириной  на  полувысоте  20  нм.  Третью  группу  лабораторных  животных  (интактная  группа  или  норма)  составили  10  крыс,  не  подвергавшихся  облучению.  Забор  мышечной  ткани  бедра  и  сыворотки  крови  производился  на  третьи  сутки  во  всех  группах  животных.

Интенсивность  свободно-радикального  окисления  в  мышечной  ткани  и  сыворотке  крови  лабораторных  животных  оценивали  по  содержанию  продуктов  окислительной  модификации  белков  (ОМБ):  алифатических  альдегид-  и  кетон-динитрофенилгидразонов  нейтрального  и  основного  характера.

Состояние  антиоксидантной  системы  оценивали  по  активности  ГSТ  —  фермента,  ответственного  за  конъюгацию  сульфгидрильной  SH₂  группы  с  электрофильными  атомами  C,  N,  S,  O  молекул  ксенобиотиков.  ГSТ  катализирует  реакцию  глутатиона  с  различными  алифатическими,  ароматическими,  эпоксидными  и  гетероциклическими  радикалами  экзогенных  повреждающих  веществ.  ГSТ  найдены  у  всех  млекопитающих,  а  также  растений  [5].  Каталитическая  активность  ГSТ  обеспечивает  клетку  механизмом  защиты  от  вредного  воздействия  активных  форм  кислорода  [7].

Исследование  ОМБ  проводили  по  методу  Е.Е.  Дубининой  [4],  основанному  на  реакции  взаимодействия  окисленных  аминокислотных  остатков  белков  с  2,4-динитрофенилгидразином  с  образованием  производных  2,4-динитрофенилгидразона.  Образовавшиеся  карбонильные  группировки  характеризуют  степень  деструкции  белковых  молекул  в  результате  свободнорадикального  окисления. 

Анализ  активности  ГSТ  проводили  по  скорости  образования  глутатион-S-конъюгатов  между  восстановленным  глутатионом  и  1-хлор-2,4-динитробензолом  по  методу  W.H.  Habig  [6]. 

Статистическую  обработку  результатов  осуществляли  с  помощью  пакета  прикладных  программ  для  обработки  биологической  и  медицинской  информации  Вiostat.  Распределение  полученных  результатов  оказалось  ненормальным,  поэтому  для  определения  различий  между  группами  был  использован  непараметрический  критерий  Фишера.  Достоверными  считались  различия  при  р≤0,05.  Результаты  представлены  в  виде  М±σ,  где  М  —  среднее  значение,  а  σ  —  среднее  квадратичное  отклонение.

Результаты  и  обсуждение. 

При  исследовании  ГSТ  в  сыворотке  крови  лабораторных  животных  опытной  группы  обнаружено  достоверное  увеличение  активности  фермента  по  сравнению  с  контрольной  группой  (р<0,01),  при  этом  активность  фермента  в  сыворотке  крови  увеличилась  на  55,5  %  (табл.1).

Таблица  1.

Активность  ГSТ  в  сыворотке  крови  контрольной  и  опытной  группы  лабораторных  животных  в  сравнении  с  нормой

Примечание:  *  —  статистически  значимые  различия  между  нормой  и  контрольной  группой  (р≤0,05);

**  —  статистически  значимые  различия  между  контрольной  и  опытной  группами  (р≤0,05).

Кроме  того,  из  таблицы  1  видно,  что  различия  между  интактной  группой  (норма)  и  опытной  группой  отсутствуют,  что  свидетельствует  о  нормализации  активности  антиоксидантного  фермента  после  коррекции  нарушений  низкоинтенсивным  красным  светом.  Снижение  активности  ГSТ  в  контрольной  группе  связано  с  угнетающим  действием  мощного  лазерного  излучения,  затрагивающее  все  системы  организма  и  также  выражающееся  в  угнетении  антиоксидантной  системы  организма.  Активация  ГSТ  в  опытной  группе,  по  нашему  мнению,  вызвана  дополнительным  синтезом  металлсодержащих  антиоксидантных  ферментов  таких,  как  супероксиддисмутаза,  каталаза  и  т.  д.,  имеющих  спектр  поглощения  в  красной  области  видимого  света,  в  ответ  на  воздействие  низкоинтенсивным  красным  светом  [8],  т.  е.  общим  повышением  активности  антиоксидантной  системы  организма.

При  анализе  продуктов  ОМБ  в  сыворотке  крови  и  мышечной  ткани  лабораторных  животных  установлено,  что  воздействие  мощным  лазером  видимого  спектра  сопровождается  достоверным  повышением  содержания  продуктов  окисления  в  биоматериале  (р<0,01),  а  последующее  облучение  широкополосным  красным  светом  вызывает  снижение  данных  продуктов  до  уровней,  близких  к  нормальным  по  многим  показателям  (табл.  2  и  табл.  3).

Таблица  2.

Содержание  продуктов  ОМБ  в  мышечной  ткани  бедра  контрольной  и  опытной  группы  в  сравнении  с  нормой

Примечание:  *  —  статистически  значимые  различия  между  нормой  и  контрольной  группой  (р≤0,05);

**  —  статистически  значимые  различия  между  нормой  и  опытной  группой  (р≤0,05);

***  —  статистически  значимые  различия  между  контрольной  и  опытной  группами  (р≤0,05).

Таблица  3.

Содержание  продуктов  ОМБ  в  сыворотке  крови  контрольной  и  опытной  группы  в  сравнении  с  нормой

Примечание:  *  —  статистически  значимые  различия  между  нормой  и  контрольной  группой  (р≤0,05);

**  —  статистически  значимые  различия  между  нормой  и  опытной  группой  (р≤0,05);

***  —  статистически  значимые  различия  между  контрольной  и  опытной  группами  (р≤0,05).

В  таблицах  2  и  3  продукты  ОМБ  (алифатические  альдегид-  и  кетон-динитрофенилгидразоны  нейтрального  и  основного  характера)  указаны  в  соответствии  с  длинами  волн,  на  которых  у  данных  продуктов  наблюдается  максимум  поглощения:  для  алифатических  альдегид-динитрофенилгидразонов  нейтрального  характера  спектр  поглощения  зарегистрирован  в  диапазоне  260—558  нм;  алифатических  альдегид-динитрофенилгидразонов  основного  характера  —  в  диапазоне  258—264  и  428—520  нм;  алифатических  кетон-динитрофенилгидразонов  нейтрального  характера  —  363—367  нм;  алифатических  кетон-динитрофенилгидразонов  основного  характера  —  430—434  и  524—535  нм  [4].  Достоверное  снижение  содержания  продуктов  ОМБ  в  мышечной  ткани  бедра  опытной  группы  животных  до  уровней,  близких  к  нормальным  свидетельствует  об  активации  антиоксидантной  системы  организма.  По-видимому,  основным  фактором,  приводящим  к  повышению  активности  антиоксидантных  ферментов  после  облучения  крыс  мощным  лазером,  является  последующее  облучение  красным  широкополосным  светом.  При  этом  эффект  снижения  продуктов  ОМБ  более  явно  наблюдался  при  исследовании  непосредственно  облученной  мышечной  ткани,  чем  при  исследовании  сыворотки  крови.  Кроме  того,  между  количеством  продуктов  ОМБ  и  активностью  ГSТ  в  сыворотке  крови  контрольной  и  опытной  групп  наблюдалась  корреляция,  сила  которой  варьировалась  от  слабой  до  средней  для  разных  продуктов  ОМБ.  В  контрольной  группе  корреляция  между  содержанием  продуктов  ОМБ  и  активностью  ГSТ  была  положительной  и  имела  среднюю  силу  (0,7  для  алифатических  кетон-динитрофенилгидразонов  нейтрального  характера  и  0,6  алифатических  кетон-динитрофенилгидразонов  основного  характера).  В  опытной  группе  корреляция  между  данными  параметрами  оказалась  отрицательной  и  имела  слабую  силу  (от  0,3  до  0,4  для  всех  продуктов).  Ранее  сходные  результаты  получены  при  изучении  корректирующего  действия  низкоинтенсивного  красного  света  после  облучения  лабораторных  животных  гамма-излучением  [1]. 

Заключение.  Исходя  из  результатов  проведенного  исследования,  можно  сделать  вывод,  что  облучение  мышечной  ткани  крыс  высокоинтенсивным  лазером  видимого  спектра  вызывает  снижение  активности  глутатион-S-трансферазы  в  сыворотке  крови.  Также  после  воздействия  лазером  происходит  повышение  уровня  продуктов  ОМБ  в  сыворотке  крови  и  мышечной  ткани  животных.  Последующее  облучение  той  же  области  широкополосным  красным  светом  приводит  к  снижению  количества  продуктов  ОМБ  в  сыворотке  крови  и,  в  особенности,  в  мышечной  ткани  бедра  крыс.  Данный  эффект,  возможно,  связан  с  повышением  активности  антиоксидантных  ферментов,  в  том  числе  глутатион-S-трансферазы  после  воздействия  широкополосным  красным  светом.  Таким  образом,  низкоинтенсивный  красный  свет  обладает  корректирующим  действием,  направленным  на  нормализацию  активности  антиоксидантной  системы. 

Список  литературы

1.Баврина  А.П.,  Монич  В.А.,  Малиновская  С.Л.,  Яковлева  Е.И.,  Бугрова  М.Л.,  Ермолаев  В.С.,  Дружинин  Е.А.  Эффекты  последовательного  воздействия  гамма-излучением  и  низкоинтенсивным  красным  светом  на  мышечные  ткани  крыс  //  Вестник  нижегородского  университета  им.  Н.И.  Лобачевского.  —  2013.  —  №  2(1).  —  С.  113—117.

2.Баврина  А.П.,  Монич  В.А.,  Ермолаев  В.С.,  Дружинин  Е.А.,  Лютов  С.И.  Фотомодификация  свободно-радикального  окисления  в  мягких  тканях  крыс  после  воздействия  ионизирующей  радиацией  //  Вестник  новых  медицинских  технологий.  —  2012.  —  №  3.  —  С.  173—174.

3.Владимиров  Ю.А.  Три  гипотезы  о  механизме  действия  красного  (лазерного)  света.  М.:  НИИ  физ.-хим.  медицины,  1994.  —  С.  23—35.

4.Дубинина  Е.Е.,  Бурмистров  С.О.,  Ходов  Д.А.  Окислительная  модификация  белков  сыворотки  крови  человека,  метод  ее  определения  //  Вопросы  медицинской  химии.  —  1995  —  №  41.  —  С.  24—26.

5.Кулинский  В.И.  Обезвреживание  ксенобиотиков  //  Соросовский  образовательный  журнал.  —  1999.  —  №  1,  —  С.  8—12. 

6.Медицинские  лабораторные  технологии  /  Под  ред.  А.И.  Карпищенко.  СПб.:  Интермедика,  —  2002.  —  Т.  2.  —  400  с.

7.Cao  K.,  Stack  D.E.,  Ramanathan  R.,  Gross  M.L.,  Rogan  E.G.,  Cavalieri  E.L.  Synthesis  and  structure  elucidation  of  estrogen  quinones  conjugated  with  cysteine,  N-acetylcysteine,  and  glutathione  //  Chem.  Res.  Toxicol.  —  1998.  —  Vol.  11.  —  P.  908—916.

8.Monich  V.,  Drugova  O.,  Lazukin  V.,  Bavrina  A.  Low-power  light  and  isolated  rat  hearts  after  ischemia  of  myocardium  //  Journal  of  Photochemistry  and  Photobiology.  —  2011.  —  Vol.  105  —  P.  21—24.