БИОЛОГИЧЕСКАЯ  АКТИВНОСТЬ  ЭКСТРАКТОВ  И  ЭФИРНОГО  МАСЛА  ARTEMISIA  PROCERIFORMIS  KRASCH.  АНАТОМИЧЕСКОЕ  СТРОЕНИЕ  ЕГО  РАСТИТЕЛЬНОГО  СЫРЬЯ

Омарова  Ақ ерке

младший  научный  сотрудник  института  прикладной  химии,  студентка  4  курса  кафедры  химии  ЕНУ  им.  Л.Н.  Гумилева,  Республика  Казахстан,  г.  Астана

Е-mail:  

Ишмуратова  Маргарита  Юлаевна

канд.  биол .  наук,  доцент  кафедры  фармацевтических  дисциплин  Карагандинского  университета  «Болашак»,  Республика  Казахстан,  г.  Караганды

Е-mail: 

Искакова  Жанар  Бактыбаевна

канд.  хим.  наук ,  ведущий  научный  сотрудник  института  прикладной  химии  ЕНУ  им.  Л.Н.  Гумилева,  Республика  Казахстан,  г.  Астана

Е-mail:   zhanariskakova@mail.ru

Cүлеймен  Ерлан  Мэлсұлы

канд.  хим.  наук ,  PhD,  директор  института  прикладной  химии,

доцент  кафедры  химии  ЕНУ  им.  Л.Н.  Гумилева,  Республика  Казахстан,  г.  Астана

Е-mail: 

BIOLOGYCAL  ACTIVITY  OF  EXTRACTS  AND  ESSENTIAL  OIL  OF  ARTEMISIA  PROCERIFORMIS  KRASCH.  ANATOMICAL  STRUCTURE  OF  ITS  PLANT  MATERIAL

Omarova  Akerke

j unior  Researcher  of  the  Institute  of  Applied  Chemistry  of  ENU,  4th  year  student  of  the  Chemistry  Department  of  L.N.  Gumilev  ENU,  Republic  of  Kazakstan,  Astana

Ishmuratova  Margarita

candidate  of  biol.  Sciences,  assistant  Professor  of  Pharmaceutical  Sciences

Karaganda  University  "Bolashak",  Republic  of  Kazakstan,  Karagandy

Iskakova  Zhanar

candidate  of  Chem.  Science ,  Leading  Researcher  of  the  Institute  of  Applied  Chemistry  of  ENU,  Republic  of  Kazakstan,  Astana

Suleimen  Yerlan

c andidate  of  Chem.  Science,  PhD,  Chief  Researcher  of  the  Institute  of  Applied  Chemistry  of  ENU,  Associate  Professor  of  Chemistry  Department  of  L.N.  Gumilev  ENU,  Republic  of  Kazakstan,  Astana

АННОТАЦИЯ

Проведено  изучение  антирадикальной  и  цитотоксической  активности  наработанных  экстрактов  и  эфирного  масла  Artemisia  proceriformis,  изучено  анатомическое  строение  растения.

ABSTRACT

The  study  of  antiradical  and  cytotoxical  activity  of  Artemisia  proceriformis  extracts  and  essential  oil  and  anatomy  structure  of  plant  material  was  done.

Ключевые  слова:  антирадикальная  активность;  DPPH;  цитотоксическая  активность;  анатомическое  строение;  экстракт;  эфирное  масло;  Artemisia  proceriformis.

Keywords:  antiradical  activity;  DPPH;  cytotoxical  activity;  anatomical  structure;  extract;  essential  oil;  Artemisia  proceriformis.

Artemisia  proceriformis   Krasch.  (полынь  кустарниковая,  сем.  Asteraceae)  —  полукустарник,  до  80  см  выостой;  стебли  прямостоячие,  голые,  бурые,  в  верхней  части  олиственные.  Листья  черешковые,  в  очертании  продолговато-яйцевидные,  дважды-трижды  перисто  рассеченные.  Корзинки  полушаровидные,  1,5—2  мм  шириной,  на  коротких  ножках.  Цветки  —  краевые  пестичные,  центральные  —  обоеполые.  Плод  —  семянка.  Вид  растет  в  сухих  степях  и  пустынях,  на  суглинистых  почвах,  солончаках.  В  долинах  рек.  На  галечниках  и  по  берегам  озер  [7].  Встречается  в  Кустанайской,  Павлодарской,  Акмолинской,  Карагандинской,  Актюбинской  и  Жамбылской  областях.

Ранее  из  нее  нами  были  выделены  СО₂-экстракт  [9]  и  эфирное  масло  [6]  и  методом  хроматомасс-спектрометрии  изучены  их  компонентные  составы.

Объектом  же  исследования  являются  эфирное  масло  и  сухие  экстракты  листьев  и  цветков,  в  качестве  экстрагентов  были  использованы  вода,  этанол,  этилацетат  и  хлороформ.

Целью  работы  явилось  изучение  антирадикальной  активности,  хлороформного,  этилацетатного  и  этанольного  экстрактов;  цитотоксической  активности  эфирного  масла  и  водного,  этанольного,  хлороформного  и  этилацетатного  экстрактов  растения  A.  proceriformis  и  исследование  анатомического  строения  растения.

Исходное  сырье  собирали  в  окрестностях  г.  Астаны  в  первой  декаде  сентября  2014.

Экстракция.  Мелкоизмельченную  надземную  часть  (листья,  цветочные  корзинки)  A.  proceriformis  экстрагировали  с  соответствующими  растворителями  на  аппарате  Сосклета  до  полного  извлечения  экстрактивных  веществ,  что  контролировалось  визуально  по  цвету.  Извлечение  упаривали  на  роторном  испарителе. 

Выделение  эфирного  масла  проводили  на  полупромышленной  установке  модуль-7У  «Альфа-Эфир-Миди»  в  течение  3-х  часов.  Выход  эфирного  масла  составил  0,4  %  в  пересчете  на  воздушно-сухое  сырье.

Исследование  антирадикальной  активности  экстрактов

Методика  исследования  антирадикальной  активности.   Для  определения  ингибирования  2,2-дифенил-1-пикрилгидразилрадикала  к  0,1  мл  исследуемого  образца  в  диапазоне  концентраций  0,1;  0,25;  0,5;  0,75;  1  мг/мл  добавляли  3  мл  6×10‾⁵  М  раствора  радикала.  Центрифужные  пробирки  находились  в  штативе,  завернутого  в  черный  полиэтилен.  После  интенсивного  перемешивания  растворы  оставлялись  в  темноте  и  через  30  минут  производили  измерение  оптической  плотности  при  длине  волны  520  нм.  Значения  величины  антирадикальной  активности  (АРА)  исследуемых  объектов  определяли  по  формуле:

АРА  (%)=А₀-А_t  /А₀×100,

где:  А₀  —  оптическая  плотность  контрольной  пробы; 

А_t  —  оптическая  плотность  рабочего  раствора  [8].

Измерение  оптической  плотности  исследуемых  экстрактов  производили  при  520  нм  на  приборе  Cary  60.  Антирадикальную  активность  исследуемых  экстрактов  сравнивали  с  антирадикальной  активностью  бутилгидроксианизола  (BHA).  Значения  исследуемых  экстрактов  антирадикального  эффекта,  рассчитанные  по  формуле,  приведены  в  таблице  1.

Таблица  1. 

Антирадикальная  активность  (%)  экстрактов  при  разных  концентрациях

На  основании  полученных  данных  (табл.  1)  и  графика  (рис.  1)  видно,  что  исследованные  этанольные  и  этилацетатные  экстракты  в  концентрации  0,5—1  A.  proceriformis  имеют  антирадикальную  активность  близкую  к  активности  ВНА.

Рисунок  1.   Динамика  антирадикальной  активности  при  изменении  концентрации  образцов

Исследование  цитотоксической  активности 

Методика  исследования  цитотоксичекой  активности   [5].  Делительную  воронку  на  55  мл  заполняли  искусственной  морской  водой  и  добавляли  200  мг  яиц  Artemia  salina.  Выдерживали  в  течение  3-х  дней  при  мягкой  подаче  воздуха  пока  рачки  не  вывелись  из  яиц.  Одну  сторона  трубы  покрывали  алюминиевой  фольгой,  и  5  мин  спустя,  личинок,  которые  собирались  на  яркой  стороне  делительной  воронки,  вынимали  пипеткой  Пастера.

20—40  личинок  помещали  в  990  ml  морской  воды  в  каждой  из  24  микроплошек.  Подсчитывали  мертвых  личинок  под  микроскопом.  Добавляли  по  10  ml  раствора  диметилсульфоксида  на  10  мг/мл  образца.  В  качестве  препарата  сравнения  использовали  актиномицин  Д  или  стауроспорин.  Для  отрицательного  контроля  добавляли  только  10  ml  диметилсульфоксида.  После  24  ч  инкубации  и  дальнейшем  выдерживании  микроплошки  в  течение  24  ч  (для  обеспечения  неподвижности)  посчитывали  мертвые  личинки  под  микроскопом.  Образцы  с  высокой  цитостатической  эффективностью  (менее  5  %  выживших  личинок)  проверяли  снова  с  концентрациями  50,  10,  5  и  1  mg/ml.

Смертность  P  определяли  по  следующей  формуле:

P  =  (A  –  N  –  B)/Z  ×  100,

здесь  A  —  количество  мертвых  личинок  после  24  ч;

N  —  количество  мертвых  личинок  до  проведения  теста; 

B  —  среднее  количество  мертвых  личинок  в  отрицательном  контроле;

Z  —  общее  количество  личинок

Проведено  изучение  цитотоксической  активности  эфирного  масла  A.  proceriformis  (таблицы  2—4).

Таблица  2. 

Эфирное  масло  A.  proceriformis  10  мг/мл

Таблица  3. 

Эфирное  масло  A.  proceriformis  5  мг/мл

Таблица  4. 

Эфирное  масло  A.  proceriformis  1  мг/мл

На  основании  проведенного  эксперимента  можно  предположить,  что  эфирное  масло  A.  proceriformis  во  всех  испытанных  концентрациях  проявляют  острую  летальную  токсичность  —  все  личинки  погибают.

Также  проведено  изучение  цитотоксической  активности  водного,  хлороформного,  этанольного  и  этилацетатного  экстрактов  A.  proceriformis  (таблицы  5—16).

На  основании  проведенного  эксперимента  можно  предположить,  что  все  экстракты  A.  proceriformis  во  всех  исследуемых  концентрациях  не  проявляют  цитотоксическую  активность.

Таблица  5. 

Экстракт  A.  proceriformis  (водный)   10  мг/мл

Таблица  6. 

Экстракт  A.  proceriformis  (водный)   5  мг/мл

Таблица  7. 

Экстракт  A.  proceriformis  (водный)   1  мг/мл

Таблица  8. 

Экстракт  A.  proceriformis  (хлороформ)  10  мг/мл

Таблица  9. 

Экстракт  A.  proceriformis  (хлороформ)  5  мг/мл

Таблица  10. 

Экстракт  A.  proceriformis  (хлороформ)  1  мг/мл

Таблица  11. 

Экстракт  A.  proceriformis  (этилацетат)  10  мг/мл

Таблица  12. 

Экстракт  A.  proceriformis  (этилацетат)  5  мг/мл

Таблица  13. 

Экстракт  A.  proceriformis  (этилацетат)  1  мг/мл

Таблица  14. 

Экстракт  A.  proceriformis  (этанол)  10  мг/мл

Таблица  15. 

Экстракт  Artemisia  proceriformis  (этанол)  5  мг/мл

Таблица  16. 

Экстракт  Artemisia  proceriformis  (этанол)  1  мг/мл

Анатомическое  исследование  A.  proceriformis  Krasch.  (сем.  Asteraceae)

Материалы  и  методы.  При  исследовании  Artemisia  proceriformis  Krasch.  (полынь  кустарниковая)  сухие  образцы  сырья  размачивали  в  горячей  воде  и  размягчали  в  смеси  глицерин-спирт-вода  дистиллированная  в  соотношении  1:1:1  [2;  4],  кипятили  в  5  %-ном  водном  растворе  гидроксида  калия.  Изготавливали  поверхностные  препараты  и  срезы  вручную.  Рисунки  выполняли  при  помощи  аппарата  РА-4М.  При  описании  анатомического  строения  использовали  принципы,  изложенные  в  трудах  В.Н.  Вехова,  Л.И.  Лотовой  [1;  3].

Анатомия.  Клетки  верхнего  эпидермиса  округлые,  со  слабо  извилистыми  стенками,  нижнего  эпидермиса  —  извилисто-стенные,  больше  по  размеру  (рис.  2).  Устьица  аномоцитного  типа  (окружены  4  и  более  клетками  эпидермы)  и  встречаются  на  обеих  сторонах  листа.  Эфирно-масличные  железки  округлой  формы,  приподнимаются  над  поверхностью  эпидермиса. 

Под  нижним  и  верхним  эпидермисом  просматриваются  темно-окрашенные  вместилища  схизогенного  происхождения,  овальной  формы,  в  которых  отмечено  накопление  эфирного  масла.  В  некоторых  неспециализированных  паренхимных  клетках  наблюдаются  капли  эфирного  масла.

Рисунок  2  -  Препарат  листа  A .  proceriformis  с  поверхности.  Ув.  10х15:  ВЭ  —  верхний  эпидермис,  НЭ  —  нижний  эпидермис,  ВМ  —  вместилища  с  эфирным  маслом,  1  —  основные  клетки  эпидермиса,  2  —  эфирно-масличные  железки,  3  —  устьица,  4  —  неспециализированные  паренхимные  клетки  с  каплями  эфирного  масла

На  поперечном  срезе  лист  амфистоматический  (столбчатый  мезофил  расположен  под  верхним  и  нижним  эпидермисом)  (рис.  3).  Эпидермис  мелкоклеточный,  покрыт  многочисленными  эфирно-масличными  железками.  Столбчатый  мезофил  двухслойный,  губчатый  —  представлен  рыхлыми  паренхимными  клетками.  Проводящая  система  представлена  центральными  и  боковыми  пучками.  Пучки  коллатеральные,  закрытые.  Ксилема  расположена  сверху,  флоэма  —  снизу.  Сверху  пучки  имеют  «шапку»  из  тяжей  склеренхимы. 

Рисунок  3.  Поперечный  срез  листа  A .  proceriformis  (схема).  Ув.  10х15:  1  —  верхний  эпидермис,  2  —  нижний  эпидермис,  3  —  столбчатый  мезофил,  4  —  губчатый  мезофил,  5  —  склеренхима,  6  —  ксилема,  7  —  флоэма,  8  —  эфирно-масличная  железка,  9  —  схизогенное  вместилище

Цветки  в  цветочной  корзинки  полыни  кустарниковой  многочисленные,  двух  типов:  центральный  обоеполые  и  периферические  —  пестичные  (рис.  4). 

Обоеполый  цветок  —  широко-колокольчатый,  околоцветник  сросшийся,  хорошо  видны  5  зубчиков  в  верхней  части.  Основание  цветка  —  овальное,  на  нижней  стороне  виден  след  от  крепления  цветка  в  цветочной  корзинке.  поверхность  покрыта  многочисленными  эфирно-масличными  железками.  пестичный  цветок  узко-трубчатый,  эфирно-масличные  железки  сидячие  и  многочисленные.  Эпидермис  обоих  типов  цветков  представлен  мелкими  прямоугольными  клетками  с  прямыми  стенками.  Опушение  не  наблюдается.

Рисунок  4.  Внешний  вид  обоеполого  и  пестичного  цветка  A .  proceriformis.  Ув.  5х10,  10х15:  А  —  обоеполый  цветок,  Б  —  эпидермис  венчика  цветка,  В  —  пестичный  цветок,  1  —  основные  клетки  эпидермиса,  2  —  эфирно-масличные  железки

Листочки  обвертки  наружные  —  эллиптические;  внутренние  —  широко-эллиптические,  У  обоих  типов  центральные  части  травянистые,  по  краям  —  пленчатые  (рис.  5). 

Рисунок  5.  Строение  эпидермиса  листочков  обвертки  A .  proceriformis.  Ув.  5х10,  10х15:  А  —  внешний  вид  листочка  обвертки,  Б  —  эпидермис  пленчатого  края,  В  —  эпидермис  травянистой  части,  1  —  основные  клетки  эпидермиса,  2  —  эфирно-масличные  железки

По  поверхности  листочков  обвертки  разбросаны  многочисленные  эфирно-масличные  железки,  приподнимающиеся  над  поверхностью.  Поверхность  густо  опушена  простыми  одноклеточными  трихомами,  формирующими  белое  войлочное  опушение.

Стебель  на  поперечном  срезе  округло-ребристый.  По  периферии  стебель  покрыт  1-слойным  эпидермисом.  Углы  занимают  участки  уголковой  колленхимы,  зона  хлоренхимы  имеет  кольцевое  строение.  К  ней  с  внутренней  стороны  плотно  прилегает  эндодерма  (рис.  6). 

Проводящая  система  пучкового  типа.  Пучки  коллатеральные,  закрытые,  сверху  имеют  тяж  из  склеренхимы.  Центральная  часть  заполнена  паренхимными  клетками.

Рисунок  6.  Поперечный  срез  стебля  A.  proceriformis.  Схема.  Ув.  5х10:  1  —  эпидермис,  2  —  колленхима,  3  —  хлоренхима,  4  —  склеренхима,  5  —  флоэма,  6  —  ксилема,  7  —  паренхима

Таким  образом,  типичными  элементами  анатомического  строения  полыни  кустарниковидной  являются:  форма  клеток  эпидермиса,  клетки  с  каплями  эфирного  масла,  размещение  вместилищ  и  отсутствие  опушения.

Список  литературы:

1.Вехов  В.Н.,  Лотова  Л.И.,  Филин  В.Р.  Практикум  по  анатомии  и  морфологии  высших  растений.  М.:  МГУ,  1980.  —  560  с.

2.Долгова  А.А.,  Ладыгина  Е.Я.  Руководство  к  практическим  занятиям  по  фармакогнозии.  М.:  Медицина,  1977.  —  255  с.

3.Лотова  Л.И.  Ботаника:  Морфология  и  анатомия  высших  растений.  М.:  КомКнига,  2007.  —  512  с.

4.Прозина  М.Н.  Ботаническая  микротехника.  М.:  Высшая  школа,  1960.  —  206  с.

5.Сүлеймен  Е.М.  Компоненты  Peusedanum  morisonii  Bess.  и  их  антимикробная  и  цитотоксическая  активность  //  Химия  природ.  соедин.,  2009.  —  45(5).  —  С.  710—711  [Chemistry  of  Natural  Compounds,  2009.  —  Vol.  45-  5.  —  Р.  710—711].

6.Сүлеймен  Е.М.,  Ткачев  А.В.,  Адекенов  С.М.  Состав  эфирного  масла  некоторых  видов  полыней  //  Химия  природ.  соедин.,  2010.  —  С.115—118  [Chemistry  of  Natural  Compounds,  —  2010.  —Vol.  46-1.  —  C.  135—139].

7.Флора  Казахстана.  Т.  9.  Алма-Ата:  Наука,  1966.  —  520  с.

8.Sawant  O.,  Kadam  V.J.,  Ghosh  R.  In  vitro  Free  Radical  Scavenging  and  Antioxidant  Activity  of  Adiantum  lunulatum  //  Journal  of  Herbal  Medicine  and  Toxicology.  —  2009.  —  №  3(2).  —  P.  39—44.

9. Suleimen  Ye.M.,  Machmudah  S.,  Ishmuratova  M.Y.,  Sasaki  M.,  Goto  M.  Composition  of  supercritical  CO₂-extracts  of  Artemisia  species  from  Kazakhstan  /  VII  Международная  научно-практическая  конференция:  сборник  материалов  Караганды,  2010.  —  С.  257—263.