СОСТОЯНИЕ ФЕРМЕНТНОЙ СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗА -ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗА В КРОВИ НОВОРОЖДЕННЫХ, КУРЯЩИХ ЖЕНЩИН

STATE OF THE ENZYMATIC SYSTEM GLUTATIONE REDUCTASE – GLUCOSE-6-PHOSPHATE DEHYDROGENASE IN THE BLOOD IN NEWBORNS OF SMOKING WOMEN

Ludmila Gavriliuc

Doctor of medical science, Professor,

N.Testemitanu State University of Medicine and Pharmacy,

Moldova, Chisinau

Natalia Kotova

Doctor of medical science, Professor, National Medical University,

Ukraine, Odessa

Tatyana Gavrilyuk

Neonatologist, Regional maternity hospital,

Ukraine, Odessa

АННОТАЦИЯ

Антиоксидант глутатион и антиокислительные ферменты, глутатионредуктаза (ГР) и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (Г6ФДГ), являются ингибиторами перекисного окисления липидов (ПОЛ) клеточных мембран и факторами, необходимыми для деления и дифференцировки клеток. Активность ГР и Г6ФДГ определяли в сыворотке крови из пуповины новорожденных, чьи матери курили во время беременности. Полученные результаты свидетельствовали о негативном влиянии курения на активность ферментов.

ABSTRACT

The antioxidant glutathione and antioxidative enzymes, glutathione reductase (GR) and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH), are inhibitors of lipid peroxidation (LPO) of the cell membranes and the factors, which are necessary for cell division and differentiation. Activity of GR and G6PDH were determined in the blood serum of the umbilical cord in the newborns of the smoking women. The obtained results indicated a negative effect of smoking on enzyme activity.

Ключевые слова: глутатионредуктаза; глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа; котинин; новорожденные

Keywords: glutathione reductase; glucose-6-phosphate dehydrogenase; cotinine;        newborns

Согласно статистическим данным ВОЗ в настоящее время курят 1,3 миллиарда человек. В развитых странах соотношение курящих мужчин и женщин составляет соответственно 41% и 21% [2, с.238-40; 3, с.507-8]. Наибольший вред как активное, так и пассивное курение наносит детям и беременным женщинам. Несмотря на всем хорошо известную информацию о вреде курения и негативном влиянии компонентов табачного дыма на организм беременной женщины и её будущего ребёнка, количество курящих беременных является значительным. Почти во всех странах Мира наблюдается выраженный рост числа курящих женщин [2, с.238; 11, с.378]. Это относится и к беременным женщинам, проживающим в Украине.

Никотин, угарный газ (СО), бензпирен и другие токсичные вещества, попадая в организм беременной женщины, легко проникают через плаценту к плоду. Концентрация всех токсичных веществ в тканях плода значительно выше, чем в крови матери [11, с.379]. Поступая в организм, никотин подвергается биотрансформации, в процессе которой участвуют многие ферментативные системы с образованием промежуточных метаболитов, одним из которых является котинин. Хорошо известно, что никотин негативно влияет на физическое и психическое развитие ребёнка курящей матери [4, с.887; 8].

Во время беременности возникает система «мать-плод», для которой характерны сложные обменные взаимоотношения. Организм матери подвергается воздействию не только гормонов, продуцируемых плацентой, но и продуктов обмена плода в процессе его развития [6, с.215-6]. В организме женщины происходит гормональная перестройка, её ткани и органы испытывают определённый стресс, в результате которого резко повышается количество свободных радикалов, атакующих клетки плаценты и эмбриона [5, с.1040; 6, с.215-6]. Увеличение количества свободных радикалов приводит к индукции антиоксидантной системы (АОС) защиты, механизм действия которой направлен на блокирование окисления внутриклеточных молекул свободными радикалами [7, с.190]. В первую очередь это относится к окислению полиненасыщенных жирных кислот, входящих в состав фосфолипидов клеточных мембран, перекисному окислению липидов (ПОЛ). Этому препятствует антиокислительная система, включающая супероксиддисмутазу, глутатионпероксидазу, каталазу, глутатионтрансферазу, глутатионредуктазу и др.

В организме здорового человека между процессами окисления и АОС существует равновесие, которое нарущается при чрезмерном и длительном усилении процессов ПОЛ. Это происходит при многих заболеваниях и может наблюдаться при беременности [6, с.216; 10, с.191-193]. Chelchowska M. и соавт. (2005) наблюдали повышение количества свободных радикалов и уменьшение антиоксидантов в плазме крови куривших матерей и новорожденных, как следствие окислительного стресса [5, с.1040]. В эритроцитах беременных, продолжавших курить во время беременности, были повышенными активности супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы, по сравнению с группой беременных, прекративших курение до наступления беременности.

Целью данного исследования было проведение сравнительного анализа уровня активности глутатионредуктазы и сопряжённого с ней фермента, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, в сыворотке крови из пуповины новорожденных куривших во время беременности женщин и не куривших.

Материал и методы

Исследование было проведено согласно заключённому Договору о научном сотрудничестве между Кишинёвским и Одесским государственными медицинскими университетами (20.08.2003). Клинический материал (кровь) был подготовлен в Областном роддоме Одессы. Согласно этическим принципам в исследовании добровольно участвовали 62 беременные женщины (18-40 лет). В контрольную группу (группу сравнения) входили 20 не беременных, не курящих женщин соответствующего возраста. С помощью иммунохроматографического метода определяли котинин в моче женщин [4, с.887]. На основании результатов теста на наличие котинина в моче беременные женщины были разделены на две группы: 1- 44 беременные не курившие; 2- 18 беременных, не прекративших курение во время беременности. Во время родов кровь из пуповинной вены помещали в пробирку, центрифугировали при 5000 оборотов/мин в течение 15 минут. Сыворотки затем замораживали и хранили при температуре -20^о С. Замороженные сыворотки транспортировали из Одессы в специальном контейнере на кафедру биохимии и клинической биохимии государственного университета медицины и фармации им. Н. Тестемицану в Кишинёв. Сыворотки размораживались непосредственно перед определением активностей ферментов на спектрофотометре “Humalyzer 2000”. С помощью микрометодов определяли активности глутатионредуктазы [9, с.887], глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы [1, с.113] и содержание белка [12, с.1552]. Статистическую обработку полученных результатов проводили по методу Стьюдента с использованием пакета прикладных программ Microstat: Microsoft Excel 2007. Коэффициенты корреляции рассчитывали по методу Спирмена.

Результаты и обсуждение

Глутатионредуктаза (ГР) - единственный фермент, восстанавливающий окисленный глутатион, который является важным водорастворимым антиоксидантом и коферментом для многих глутатионзависимых ферментов. Результаты исследования активности ГР представлены на рис.1. Активность ГР в сыворотке крови из пуповины новорожденных не куривших женщин была 71,73 МЕ/л (83,9%; р>0,05) по сравнению с активностью ГР в сыворотке крови небеременных женщин (85,47 МЕ/л). Активность ГР в сыворотке крови из пуповины новорожденных куривших женщин соответствовала 54,89 МЕ/л (64,2%;р<0,01). Уменьшение активности ГР в пуповинной крови новорожденных куривших матерей наблюдала Chelchowska M. и соавт. [5, с.1040-41].

Удельная активность ГР в сыворотке крови из пуповины новорожденных не куривших  женщин (рис. 2) была равной 5,48 МЕ/г белка (315,3%; р<0,001) по сравнению с активностью ГР в сыворотке крови небеременных женщин (1,74 МЕ/г). В сыворотке крови из пуповины новорожденных куривших во время беременности женщин активность ГР соответствовала 3,25 МЕ/г белка (186,8%; р<0,001). Полученные результаты исследования показали, что курение значительно понижает активность ГР.

Рисунок 1. Активность ГР и Г6ФДГ в сыворотке крови

1- небеременные женщины (контроль); 2- новорожденные, не курящих женщин; 3- новорожденные, курящих женщин.

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (Г6ФДГ). Исследование активности Г6ФДГ в сыворотке крови из пуповины новорожденных (рис.1) не куривших женщин показало повышение её активности до 88,34 МЕ/л (162,7%; р<0,01) по сравнению с контролем (54,28 МЕ/л), активностью Г6ФДГ в сыворотке крови небеременных женщин. В сыворотке крови из пуповины новорожденных куривших во время беременности женщин активность Г6ФДГ также повышалась до 78,6 МЕ/л (144,8%; р<0,01). Удельная активность Г6ФДГ (рис. 2) также была повышенной в сыворотке крови из пуповины новорожденных, как у не куривших до 7,31 МЕ/г белка (659,7%; р<0,001), так и у куривших женщин во время беременности до 4,0 МЕ/г (361,4%; р<0,001) по сравнению с активностью Г6ФДГ в сыворотке небеременных женщин (1,11 МЕ/г).

Рисунок 2. Удельные активности ГР и Г6ФДГ в сыворотке крови

1- небеременные женщины (контроль); 2- новорожденные, не курящих женщин; 3- новорожденные, курящих женщин.

Пентозофосфатный путь апотомического окисления глюкозы, локализованный в матриксе митохондрий, генерирует около 65-70% НАДФН, кофермента, который необходим для функционирования ГР и многих других энзимов. НАДФН является необходимым для синтеза жирных кислот, липидов, холестерола, стероидных гормонов, желчных кислот, обезвреживания эндотоксинов и экзотоксинов, лекарств монооксигеназной цепью микросомального окисления при участии цитохрома Р₄₅₀. Пентозофосфатный путь является единственным полиферментным комплексом, где происходит образование пентозы (рибозы-5-фосфата), необходимой для синтеза мононуклеотидов. Нуклеотиды используются для синтеза нуклеиновых кислот, коферментов (НАД, ФМН, НАДФ), макроэргов (АТФ, ГТФ), циклических мононуклеотидов (3,5-цАМФ, 3,5-цГМФ), являющихся вторичными посредниками между гормонами и внутриклеточными ферментами.

Наблюдаемое существенное повышение активности Г6ФДГ в сыворотке крови из пуповины новорожденных, вероятно, отражает метаболические потребности организма матери и плода. Повышение активности ГР и Г6ФДГ в эритроцитах новорожденных наблюдали Frosali S. И соавт. [7, с.190], сделав вывод о центральной роли Г6ФДГ в антиоксидантной защите организма.

Корреляционный анализ. Результаты поиска корреляционных взаимоотношений между сопряжёнными энзимами, ГР и Г6ФДГ, представлены в таблице.

Таблица

Корреляционные взаимоотношения между активностью ГР и Г6ФДГ в сыворотке пуповинной крови новорожденных

Поиск корреляционных отношений между ГР и Г6ФДГ с применением непараметрического критерия Спирмена показал, что в сыворотке пуповинной крови всех новорожденных наблюдалась тесная функциональная связь этих энзимов с высоким уровнем надёжности.

Таким образом, полученные результаты исследования показали, что курение существенно влияет на активность ГР и Г6ФДГ. В пуповинной крови новорожденных, не куривших матерей, активность Г6ФДГ была значительно выше, чем в группе не беременных женщин, что можно объяснить возросшими метаболическими потребностями плода и матери. В крови новорожденных куривших матерей активность Г6ФДГ повышалась менее значительно, что свидетельствует о токсическом влиянии курения.

Список литературы:

1. Сейц И.Ф., Луганова И.С. Метод определения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в лейкоцитах.//Биохимия клеток крови.- М., 1967,- C. 113-114.
2. Amos A., Greaves L., Nichter M. Women and tobacco: a call for including gender in tobacco control research, policy and practice.// Tob. Control. 2012.  V. 21. № 2. P. 236-243.
3.  Anderka M., Romitti P.A., Sun L. National Birth Defects Prevention Study. Patterns of tobacco exposure before and during pregnancy.//Acta Obstet. Gynecol. Scand. 2010. V.89. № 4. P. 505-514.
4. Benowitz N.L., Schultz K.E, Haller C.A. Prevalence of smoking assessed biochemically in an urban public hospital: a rationale for routine cotinine screening. // Am. J. Epidemiol. 2009. V.170. № 7. P. 885-891.
5. Chełchowska M, Laskowska-Klita T, Niemiec KT. Activities of superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase in erythrocytes of women smoking during pregnancy. // Przegl. Lek. 2005. Vol. 62. № 10. P.1039-42.
6. Dordević NZ, Babić GM, Marković SD, Ognjanović BI, Stajn AS, Zikić RV, Saicić ZS. Oxidative stress and changes in antioxidative defense system in erythrocytes of preeclampsia in women. //Reprod. Toxicol. 2008. Vol. 25. № 2. P. 213-218.
7. Frosali S., Di Simplicio P., Perrone S., Di Giuseppe D. Glutathione recycling and antioxidant enzyme activities in erythrocytes of term and preterm newnorns at birth. //Biol. Neonate. 2004. Vol. 85. № 3. P.188-94.
8. Gorrod J.W., Schepers G. Biotransformation of nicotine in mammalian systems. Chapter 3. – P. 45-67. In:  J.W. Gorrod, G. Schepers. // Analytical Determination of Nicotine and Related Compounds and Their Metabolites.-  1999. 758 p.
9.  Horn H.D. Glutathione reductase. In: Bergmeyer, H.-U., ed. Methods of enzymatic analysis. New York: Academic Press, 1963, P. 875-879.
10.  Orhan H, Onderoglu L, Yücel A, Sahin G. Circulating biomarkers of oxidative stress in complicated pregnancies. //Arch. Gynecol. Obstet. 2003. Vol. 267. № 4. P.189-95.
11. Pogodina C., Brunner Huber L.R., Racine E.F. Smoke-free homes for smoke-free babies: the role of residential environmental tobacco smoke on low birth. // J. Commun. Health. 2009. V. 34. № 5. P. 376-382.
12. Watanabe N., Kamei S., Ohkuto A. Urinary protein as measured with a pyrogallol red-molybdate complex: Manually and in a Hitachi 726 automated analyzer. //Clin. Chem. 1986. Vol. 32. P.1551-1554.