СРАВНИТЕЛЬНАЯ МОРФОЛОГИЯ ПРОЛИФЕРАЦИИ И АПОПТОЗА В НЕБНОЙ МИНДАЛИНЕ У СОБАК

COMPARATIVE MORPHOLOGY OF PROLIFERATION AND APOPTOSIS IN THE PALATINE TONSIL IN DOGS

Nurbek Aldaiarov

candidate of Vet. Sciences, Assistant Professor, Kyrgyz National Agrarian University named after K.I. Scriabin,

Kyrgyzstan, Bishkek

Zarima Jumakanova

researcher of Kyrgyz National Agrarian University named after K.I. Scriabin

Kyrgyzstan, Bishkek

Abdirashit Marasulov

candidate of Biol. Sciences, Acting Associate Professor, Kyrgyz National University named after J. Balasagin,

Kyrgyzstan, Bishkek

АННОТАЦИЯ

С помощью иммуногистохимических маркеров пролиферации и апоптоза изучено морфофункциональное состояние небной миндалины у собак в норме. Тканевые пробы от небной миндалины получены от трех клинически здоровых собак в возрасте 1,5–2 года. Проведена стандартная процедура обработки соответствующих тканевых проб. Применен SaBC (Streptavidini and Biotinylated horseradish peroxidase macro-molecular Complex) метод иммуногистохимии для выявления пролиферативно-активных клеток лимфоидной ткани с использованием антител – Monoclonal Mouse Anti-Proliferating Cell Nuclear Antigen. Clon PC10 (1:400) и Monoclonal Mouse Anti-Human Ki67, Clon MIB-1 (1:150), и апоптоза клеток лимфоидной ткани – Monoclonal Rabbit Anti-Human cleaved active Caspase-3 (1:150) и Polyclonal Rabbit Anti-Human cleaved Lamin A (Small Subunit) (1:100).

Результаты микроскопического анализа показали, что небная миндалина представляет передовой барьер иммунного надзора организма, который постоянно находится в активном морфофункциональном отношении. Для выявления пролиферативно-активных клеток лимфоидной ткани необходимо использовать маркер иммуногистохимии Ki67, так как он дает более четкую реакцию, чем PCNA. Для выявления апоптоза клеток лимфоидной ткани можно использовать Caspase-3 и Lamin A. Полученные данные могут служить для контроля при изучении морфофункционального состояния лимфоидной ткани небной миндалины при патологиях собак инфекционного и неинфекционного характера.

ABSTRACT

By using immunohistochemical markers of proliferation and apoptosis studied the morphological and functional state of the palatine tonsils in dogs. Tissue samples from palatine tonsils obtained from three clinically healthy dogs aged 1,5–2 years. Following standard methods was applying for processing the relevant tissue samples. Applying SaBC (Streptavidini and Biotinylated horseradish peroxidase macro-molecular Complex) method Immunohistochemistry for identification proliferative active cells of lymphoid tissue using antibodies – Monoclonal Mouse Anti-Proliferating Cell Nuclear Antigen. Clon PC10 (1: 400) and Monoclonal Mouse Anti-Human Ki67, Clon MIB-1 (1: 150), and apoptosis of lymphoid tissue cells – Monoclonal Rabbit Anti-Human cleaved active Caspase-3 (1: 150) and Polyclonal Rabbit Anti -Human cleaved Lamin A (Small Subunit) (1: 100).

The results of microscopic analysis revealed that palatine tonsil representing good barrier of immune control of the body, is constantly in active morphofunctional relation. In order to identify active proliferative cells of lymphoid tissue is necessary to use immunohistochemical marker Ki67, as it gives a clear response than PCNA. To detect apoptosis of lymphoid tissue cells can be used Caspase-3 and Lamin A. To detect apoptosis in lymphoid tissue cells can be used Caspase-3 and Lamin A. The obtained data can serve as a control in the study of morpho-functional state of the lymphoid tissue of the palatine tonsils in pathological infectious and non-infectious diseases in dogs.

Ключевые слова: маркеры пролиферации (Ki67, PCNA), маркеры апоптоза (Lamin A, active caspase 3), небная миндалина, морфофункциональное состояние, собака.

Keywords: proliferation markers (Ki 67, PCNA), apoptosis markers (Lamin A, active caspase 3), palatine tonsil, morphofunctional state, dog.

Введение. Миндалины млекопитающих (небная, язычная, глоточная, трубная) входят в состав лимфоэпителиального глоточного кольца, которые размещены на границе ротовой, носовой полостей и глотки и образовывают лимфоидное кольцо, или кольцо Пирогова-Вальдейера [2, с. 93].

Небная миндалина является органом местного (слизистого) и системного иммунного ответа [3, с. 277; 4; 14; 15; 16]. Она занимает важную позицию, располагаясь в начале желудочно-кишечного тракта и является передовой линией иммунного надзора против алиментарных антигенов, играет ключевую роль в инициации иммунного ответа против них [2; 5]. В доступной литературе встречаются исследования, посвященные сравнительной морфологии небной миндалины у млекопитающих [8], морфологии лимфатических путей [10] и клеточного состава небной миндалины у собак [1]. Был проведен количественный анализ клеток положительно реагирующих на маркеры пролиферации и апоптоза при хроническом тонзиллите у людей [3].

При морфологических исследованиях по выявлению пролиферации клеток используют такие маркеры, как Ki-67 и PCNA, а для выявления апоптоза клеток в последние годы используются маркеры active Caspase-3 и Lamin A.

Молекула Ki-67 в период интерфазы клетки выявляется внутри ядра, а во время митоза этот белок располагается на поверхности хромосом. Антиген Ki-67 обнаруживается во всех активных фазах клеточного цикла (G ₁, S, G₂ и митозе), но отсутствует во время состояния покоя клетки в так называемой G₀ фазе. Моноклональное антитело клон MIB-1 часто используется для выявления антигена Ki-67 на пробах, фиксированных в формалине и заключенных в парафин. По данным исследователей, иммуногистохимический маркер MIB-1 против антигена Ki-67 используется при многих исследованиях, и получены нижеследующие результаты: было изучено более 75 % рака молочной железы, опухолей мягких тканей, легочных новообразований, астроцитомы и менингомы; 25–75 % цервикальных новообразований и опухолей простаты; 25 % кишечных опухолей потверждают, что маркер Ki-67 является маркером для определения пролиферации клеток [6; 9; 11; 12; 17; 18].

Маркер под называнием Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) применяется при выявлении пролиферативной активности клеток. PCNA максимально выражается в фазах клеточного цикла как G₁ и S, но также выявляется в G₀ фазе [12, с. 334; 18, с. 430]. Этот маркер показал хорошие результаты при изучении грибковых болезней.

Active Caspase-3 является эффекторным из семейства каспазов при апоптотических процессах организма. Этот эпиотоп является формалин резистентным и 100 % подходит к исследованиям апоптотических клеток человека и собак [7; 13].

Lamin A – это белок, который входит в состав структуры клеточной мембраны и является важным белком, поддерживающим функции нормальной клетки: контролирует жизненный цикл клетки, репликацию ДНК и формирование хроматина. Cleaved Lamin A (Small Subunit) антитело является маркером, выявляющим маленькие фрагменты, т. е. апоптосом при апоптотических процессах.

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования является изучение морфофункционального состояния небной миндалины у собак в норме с применением маркеров пролиферации и апоптоза, проведение сравнительно-качественного анализа между вышеизложенными маркерами. В соответствии с целью перед нами были поставлены нижеследующие задачи:

1. Микроскопическими методами исследования изучить морфофункциональное состояние небной миндалины у здоровой собаки.
2. Провести сравнительный анализ между маркерами пролиферации Ki-67 и PCNA, и апоптоза active Caspase-3 и Lamin A.

Объекты и методы исследования. Настоящая работа выполнялась на кафедре ветеринарно-санитарной экспертизы, гистологии и патологии Кыргызского национального аграрного университета им. К.И. Скрябина и в Институте ветеринарной патологии Цюрихского университета (Швейцария).

Тканевые пробы от небной миндалины получены от трех клинически здоровых собак в возрасте 1,5–2 года. Кусочки органов фиксировали в 10 %-ном водном растворе нейтрального формалина. Обезвоживание кусочков производилось в специальной машине в вакууме.

Для выявления пролиферации клеток использовали антитела Monoclonal Mouse Anti-Proliferating Cell Nuclear Antigen. Clon PC10 (1:400) и Monoclonal Mouse Anti-Human Ki67, Clon MIB-1 (1:150), апоптоза клеток – Monoclonal Rabbit Anti-Human cleaved active Caspase-3 (1:150) и Polyclonal Rabbit Anti-Human cleaved Lamin A (Small Subunit) (1:100). Был применен SaBC (Streptavidini and Biotinylated horseradish peroxidase macro-molecular Complex) метод иммуногистохимии. Для восстановления антигена в срезах использовали автоклав Паскаль (20 минут, +98⁰ С и давление 98 п) и антиген восстанавливающий цитратный буферный раствор Ph 6.0. Срезы дополнительно окрашены гематоксилином Майера. Предметные стекла с окрашенными срезами были покрыты прозрачной пленкой на специальной машине с помощью ксилола.

Результаты исследования. Небные миндалины – это парные, компактные скопления иммунокомпетентных клеток в виде лимфоидных фолликулов разной формы и величины и диффузной лимфоидной ткани. От окружающей внутренней ткани миндалина отделена волокнисто-соединительнотканной капсулой.

В тех местах, где размещены миндалины, слизистая оболочка образует неглубокие многочисленные крипты, стенки которых покрыты многослойным плоским эпителием. Покровный эпителий представляет неглубокие выпячивания между криптами, в одном участке он переходит на однослойный плоский эпителий, а непосредственно за ними располагается диффузная лимфоидная ткань. В начальном и конечном участке миндалины и боковых зонах криптов лимфоидного образования располагается многослойный эпителий, имеющий рыхло-сетчатое строение, который инфильтрирован лимфоцитами, плазматическими клетками, макрофагами, проникающими из лимфоидной ткани небной миндалины. А на апикальных плоских участках криптов миндалины четко выявляются все слои слизистой оболочки: покровный многослойный плоский эпителий, незначительный слой собственно-соединительной ткани и мышечная пластинка слизистой оболочки (Рис. 2В).

Подслизистая основа утолщена и заселена диффузной лимфоидной тканью и лимфоидными фолликулами в разных морфофункциональных состояниях.

Т-зона небной миндалины представлена в основном Т-лимфоцитами и определенным количеством макрофагов. В Т-зависимой зоне иммуннокомпетентные клетки локализованы диффузно, они также расселены вокруг лимфоидных фолликулов. Пролиферативная активность клеток по сравнению с В-зоной незначительна (Рис. 1), клетки в состоянии апоптоза и мелкие апоптосомы единичны (Рис. 2, 3Б). Ki67 или PCNA позитивные клетки распределены в Т-зоне равномерно, а Caspase-3 или Lamin A позитивные клетки обнаруживаются редко в виде одиночных клеток или группой мелких апоптосом или же отсутствуют.

В-зона небной миндалины представлена лимфоидными фолликулами разного размера, формы и структуры. Клеточный состав В-зоны в основном представлен В-лимфоцитами, лимфобластами, единичными Т-лимфоцитами и макрофагами.

По структуре лимфоидные фолликулы делятся на: лимфоидные фолликулы с четко выраженными светлыми центрами, мантийной и маргинальной зонами. Такие лимфоидные фолликулы обычно большого размера, округлой, овальной или грушевидной формы. Тонкий ободок плотно расположенных клеток (мантийная зона) заселен вокруг светлого центра, и в нем хорошо различаются зоны рыхло локализованных клеток (маргинальная зона) фолликула; лимфоидные фолликулы с нечетко выраженным светлым центром имеет более толстую мантийную зону, а маргинальная зона почти не определяется; лимфоидные фолликулы без светлого центра имеет компактно или рыхло локализованную (округлой или овальной формы) группу лимфоидных клеток, в них мантийная и маргинальная зоны не определяются; лимфоидные фолликулы большого размера и с рыхло заселенными клетками, стертой структуры мантийной зоны и светлого центра. Лимфоидные фолликулы заселены В лимфоцитами и единичными Т-лимфоцитами, что связано с функцией В-лимфоцитов и макрофагами.

Пролиферативная активность лимфоцитов хорошо выражается во всех лимфоидных фолликулах, т. е. в морфофункциональном отношении первичных и вторичных лимфофолликулах. Во вторичных или морфофункционально активных лимфофолликулах особенно интенсивно окрашиваются клетки мантийной зоны, так как приблизительно 85–90 % клеток этой зоны дают Ki67 или PCNA позитивную реакцию. В центре размножения, или герминативном (светлом) центре, их сравнительно мало, но PCNA позитивных клеток в этой зоне лимфоидного фолликула и в лимфофолликулах с нечетко выраженными светлыми центрами больше, чем Ki67 позитивных. В первичных лимфоидных фолликулах пролиферативно-активные клетки распределены равномерно, чему и свидетельствуют Ki67 и PCNA позитивные клетки.

Рисунок 1. Парафиновый срез небной миндалины клинически здоровой собаки.

А, А¹ – Ki67 позитивные клетки Т – и В-зоны небной миндалины. Monoclonal Mouse Anti-Human Ki67, Clone MIB-1 (1:150). SaBC метод иммуногистохимии. А - х25,  А¹ - х125;

Б, Б¹ – PCNA позитивные клетки Т- и В-зоны небной миндалины. Monoclonal Mouse Anti-Proliferating Cell Nuclear Antigen. Clone PC10 (1:400). SaBC метод иммуногистохимии. Б - х25,  Б¹ - х125;

В – PCNA позитивные клетки базального слоя покровного плоского эпителия небной миндалины. Monoclonal Mouse Anti-Proliferating Cell Nuclear Antigen. Clone PC10 (1:400). SaBC метод иммуногистохимии.  х250

Небные миндалины клинически здоровой собаки постоянно находятся в активном морфофункциональном отношении, что доказывается доминирующим количеством вторичных лимфофолликулов (их более 90 %), а первичных лимфоидных фолликулах незначительно. Встречаются единичные лимфофолликулы, истратившие свои ресурсы, т. е. с рыхло локализованными лимфоцитами без зон, в них наблюдается незначительное количество пролиферативно-активных клеток и значительное число клеток, окрашенных маркерами апоптоза (Рис. 2 Б, Б¹).

При иммуногистохимической окраске антитела Ki67 дают более четкие реакции, без заднего фона (Рис. 1 А,А¹), антитела PCNA также дают хорошую окраску, желто-коричневый задний фон, т. е. наблюдается нечеткая, смазанная микрокартина (Рис. 1 Б,Б¹). А также PCNA дает более интенсивную реакцию в ростковом или базальном слое многослойного плоского эпителия, чем Ki67 (Рис. 2В).

Рисунок 2. Парафиновый срез небной миндалины клинически здоровой собаки.

А,А¹ – active Caspase-3 позитивные клетки мантийной зоны и светлого центра вторичных лимфоидных фолликулов небной миндалины. Monoclonal Rabbit Anti-Human cleaved active Caspase-3 (1:150). SaBC метод иммуногистохимии.  А – х125,  А¹ - х250;

Б, Б¹ – cleaved Lamin A позитивные клетки в лимфоидном фолликуле без соответствующей гистоструктуры. Polyclonal Rabbit Anti-Human cleaved Lamin A (Small Subunit) (1:100). SaBC метод иммуногистохимии. Б – х125,  Б¹ - х250;

В  –  active Caspase-3 позитивные клетки плоского слоя покровного эпителия небной миндалины и единичные клетки лимфоидной ткани. Monoclonal Rabbit Anti-Human cleaved active Caspase-3 (1:150). SaBC

Маркерами апоптоза Caspase-3 и Lamin A выявляются клетки в состоянии распада, их можно встретить в мантийной зоне лимфоидного фолликула, а в светлом центре они незначительны (Рис. 2 А,А¹). В структуре первичных лимфофолликулов клетки в состоянии апоптоза единичны или же не выявляются. Как изложено выше, фигуры апоптоза и мелкие группы апоптосом больше в структуре лимфоидных фолликулов со стертой микрокартиной (Рис. 2 Б,Б¹).

При выявлении апоптоза иммунокомпетентных клеток маркеры Caspase-3 и Lamin A дают хорошие результаты. Маркер Caspase-3 при окрашивании дает желто-коричневый задний фон, но сигналы четкие.

В заключение можно отметить, что лимфоидная ткань небной миндалины заселяет подслизистую основу и представлен Т-, В-зонами иммунных клеток, занимая пограничное морфологическое расположение, является передовым звеном иммунной системы местного и общего назначения. Она постоянно находится в активном морфофункциональном отношении, так как количество пролиферативно-активных клеток намного преобладает над клетками в состоянии апоптоза, и наблюдается значительное количество вторичных лимфоидных фолликулов, оберегая организм собаки от внешних и внутренних антигенов.

Выводы.

1. Небная миндалина представляет передовой барьер иммунного надзора организма, постоянно находится в активном морфофункциональном отношении.
2. Для выявления пролиферативно-активных клеток лимфоидной ткани необходимо использовать маркер иммуногистохимии Ki67, так как он дает более четкую реакцию, чем PCNA.
3. Для выявления апоптоза клеток лимфоидной ткани можно использовать Caspase-3 и Lamin A.

Список литературы:

1. Иргашев А.Ш., Алдаяров Н.С., Manfred R. Морфофункциональное состояние интрамуральной лимфоидной ткани у собак в норме / Вестник КАУ. – № 1 (7). – Бишкек, 2007. – С. 150–153.
2. Манько В.М., Девришов Д.А. Ветеринарная иммунология. Фундаментальные основы // – М.: Издательство «Агровет», 2011. – С. 93.
3. Avramovi V. ¹, Petrovi V. ¹, Jovi M. ¹, Vlahovi P. ². Quantification of cells expressing markersof proliferation and apoptosis in chronic tonsillitis / ACTA otorhinolaryngologica ita lica 2015;35:277–284.
4. Brandtzaeg P. Immunology of tonsils and adenoids: everything the ENT surgeon needs to know. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 2003; 67: S. 69–76.
5. Brantzaeg P (1984) Immune functions of human nasal mucosa and tonsils in health and disease. In Immunology of the Lung and Upper Respiratory Tract (ed. J. Bienenstock,), P. 28–95. New York: McGraw-Hill.
6. Brown D.C., Gatter K.C. Ki67 protein: the immaculate deception? // Histopathology. 2002 40 (1). – Р. 2–11.
7. Drakos E., Rassidakis G.Z., Lai R. et al.Caspase-3 activation in systemic anaplastic large-cell lymphoma // Mod. Pathol. 2004. 17 (1). – Р. 109–16.
8. Effat K.G., Milad M. Comparative study of palatine tonsil histology in mammals, with special reference to tonsillar salivary glands / J Laryngol Otol. 2007, May; 121 (5) :468–71.
9. Fournel-Fleury C., Magnol J.P., Chabanne L. et al. Growth fractions in canine non-Hodgkin's lymphomas as determined in situ by the expression of the Ki-67 antigen // Comp. Pathol. 1997. 117(1). – Р. 61–72.
10. Gabrielle T. Belz,Trevor J. Heath Intercellular and lymphatic pathways of the canine palatine tonsils / J. Anat. (1995), 187. – P. 93–105.
11. Koster A., Tromp H.A., Raemaekers J.M. et al. The prognostic significance of the intra-follicular tumor cell proliferative rate in follicular lymphoma // Haematologica. 2007. 92(2). – Р. 184–90.
12. Madewell B.R. Cellular proliferation in tumors: a review of methods, interpretation, and clinical applications // Vet. Intern. Med. 2001. 15 (4). – Р. 334–40.
13. Muris J.J., Cillessen S.A., Vos W. et al. Immunohistochemical profiling of caspase signaling pathways predicts clinical response to chemotherapy in primary nodal diffuse large B-cell lymphomas // Blood. 2005. 105 (7). – Р. 2916–2923.
14. Nave H., Gebert A., Pabst R. Morphology and immunology of the human palatine tonsil. Anat Embryol (Berl) 2001; 204: 367–73.
15. Passаli D., Damiani V., Passаli G.C., et al. Structural and immunological characteristics of chronically inflamed adenotonsillartissue in childhood. Clin Diagn Lab Immunol 2004; 11: 1154–7.
16. Perry M., Whyte A. Immunology of the tonsils. Immunol Today 1998; 19: 414–21.
17. Raty R., Franssila K., Joensuu H., Teerenhovi L., Elonen E. Ki-67 expression level, histological subtype, and the International Prognostic Index as outcome predictors in mantle cell lymphoma // Haematol. 2002. 69 (1). – Р. 11–20.
18. Zacchetti A., Garderen van E., Teske E. et al Validation of the use of proliferation markers in canine neoplastic and non-neoplastic tissues: comparison of KI-67 and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expression versus in vivo bromodeoxyuridine labelling by immunohistochemistry // APMIS. 2003. 111 (3). – Р. 430–438.