БИОСОВМЕСТИМОСТЬ НЕТКАНОГО МАТРИКСА ИЗ ПОЛИМОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ

THE BIOCOMPATIBILITY OF NONWOVEN MATRIX FROM POLYLACTIC ACID

Constantin Zaitsev

Ph.D. in Medical Science, Head of  Experimental Laboratory of Biomedical Technologies of Siberian Federal Science-clinical Center of Federal medicobiological agency,

Russia, Tomsk

Igor Khlusov

professor, Ph.D. in Medical Science, Leading researcher of  Experimental Laboratory of Biomedical Technologies of Siberian Federal Science-clinical Center of Federal medicobiological agency,

 Russia, Tomsk

Oksana Zhukova

Ph.D. in Medical Science, Leading researcher of  Experimental Laboratory of Biomedical Technologies of Siberian Federal Science-clinical Center of Federal medicobiological agency,

Russia, Tomsk

Sergei Tverdokhlebov

assistant professor, Ph.D. in Physico-mathematical Science, Senior researcher of  Experimental Laboratory of Biomedical Technologies of Siberian Federal Science-clinical Center of Federal medicobiological agency,

Russia, Tomsk

Alena Gostyukhina

researcher of Experimental Laboratory of Biomedical Technologies of Siberian Federal Science-clinical Center of Federal medicobiological agency,

Russia, Tomsk

Natal’ya Abdulkina

Ph.D. in Medical Science, Deputy general director for research and clinical work of Siberian Federal Science-clinical Center of Federal medicobiological agency,

Russia, Tomsk

Victor Vorob’ev

Ph.D. in Medical Science, General director of  Siberian Federal Science-clinical Center of Federal medicobiological agency,

Russia, Seversk, Tomsk region

АННОТАЦИЯ

Исследована биологическая совместимость биодеградируемого матрикса с заданными физико-химическими характеристиками, полученного из полимолочной кислоты методом аэродинамического формирования в турбулентном газовом потоке. 20 крысам линии Wistar имплантировали подкожно по 1 тестируемому матриксу. 10 ложнооперированных крыс составили группу контроля. При проведении сравнительного гематологического анализа у животных опытной группы была выявлена выраженная лейкоцитарная реакция крови, обусловленная увеличением содержания лимфоцитов. Визуальный осмотр подкожной клетчатки показал, что в 90% случаев через 30 суток после подкожного введения полилактидного матрикса наблюдалась локальная гиперемия и усиление рисунка кровеносного русла на прилегающей к имплантату территории внутренней поверхности кожи. Микроскопическое исследование продемонстрировало пальцеобразное врастание соединительной ткани в структуру полилактидного матрикса, преимущественно с торца тестируемых изделий. Тестируемый материал не вызывал отрицательных реакций окружающих тканей живого организма.

ABSTRACT

The biological compatibility of the biodegradable matrix with the specified physical and chemical characteristics obtained from polylactic acid by the method of aerodynamic formation in turbulent gas stream has been studied. The matrices to be tested have been implanted subcutaneously in 20 Wistar rats (1 matrix in 1 rat). The control group consisted of 10 false-operated rats. Comparative hematological analysis of the animals of the experimental group has been revealed apparent leukocyte reaction of blood induced by increase of the lymphocyte content. Visual examination of subcutaneous tissue has showed that in 90% cases in 30 days after subcutaneous implantation of polylactide matrix one has observed local hyperemia and enhancement of image of blood channels on the inner skin surface being adjacent to the implant. Microscopic examination has demonstrated finger-like ingrowth of connective tissue into structure of polylactide matrix, mainly from the end of the products to be tested. The material to be tested has not induced negative reactions of the surrounding tissues of living organism.

Ключевые слова: полилактидный матрикс, биосовместимость, гематологический анализ, морфологический анализ

Keywords: polylactide matrix, biocompatibility, hematological analysis, morphological analysis

Новым направлением приложения полимеров в области регенеративной медицины является разработка трехмерных волокнистых структур (нетканых скеффолдов), имеющих высокое отношение площади поверхности к общему объему, имитирующих межклеточное волокнистое вещество различных тканей [7]. Основу данных конструкций возможно составить из материалов, способных к биодеградации, например, из полимолочной кислоты. Полилактид – это медленно деградирующий полимер, имеющий достаточную прочность на разрыв, низкое растяжение и высокий модуль упругости [9].

С другой стороны, имплантаты помимо выполнения своей основной функции являются, во многом, экстремальными раздражителями, которые способны запускать не только местные регенераторные процессы, но и вызывать системную реакцию организма [8]. В связи с этим международные и национальные стандарты рекомендуют начинать изучение биомедицинских свойств новых материалов и готовых изделий, предназначенных для длительного применения, с тестов in vitro и с экспериментальных исследований на чувствительных лабораторных животных [5, 6].

Целью настоящей работы явилась оценка биосовместимости гибридного синтетического нетканого полилактидного матрикса при его подкожной имплантации крысам линии Wistar.

Материал и методы

Экспериментальные трехмерные нетканые матриксы были изготовлены в Национальном исследовательском Томском политехническом университете методом аэродинамического формования в турбулентном газовом потоке из 4% раствора полимолочной кислоты в дихлорэтане [9]. Для тестирования использовали образцы полилактидного матрикса с линейными размерами 10×10 мм и толщиной не более 1 мм.

Экспериментальное исследование in vivo выполнено на 20 половозрелых белых крысах-самцах линии Wistar массой 240-280 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Под CО₂-наркозом в ламинарном потоке стерильного воздуха крысам  имплантировали подкожно в правую подмышечную область по 1 матриксу. В качестве контроля служила группа  из 10 ложнооперированных крыс, которым выполняли разрез кожи, подкожно вводили пинцет, формировали боковой карман и зашивали рану без введения изделий. В конце опыта (через 1 мес. после введения матриксов) крысы выводились из эксперимента одномоментным декапитированием под CО₂-наркозом с соблюдением правил эвтаназии, согласно Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации о гуманном отношении к животным и приказу Минздрава СССР №577 от 12.08.1977 «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных».

У декапитированных животных кровь собирали в стерильную пробирку, содержащую антикоагулянт ЭДТА. В периферической крови крыс измеряли общее количество лейкоцитов, содержание нейтрофильных гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов с помощью ветеринарного гематологического анализатора «PCE-90 Vet» («High Тechnology», США).

Декапитированных животных вскрывали для проведения визуального анализа состояния внутренних органов и тканей. Для определения локальной реакции на имплантат проводили макроскопическую оценку состояния матрикса (форма, размеры) и места подкожной имплантации (изменение цвета подкожной жировой клетчатки, наличие гиперемии кровеносных сосудов, признаков асептического воспаления или нагноения, инкапсуляция имплантата соединительной тканью, сцепление имплантата с соединительной тканью). Имплантаты с окружающими тканями извлекали, фиксировали в 10% нейтральном формалине, заливали в парафин, делали тонкие (10 мкм), послойные срезы, окрашивали гематоксилином и эозином. Гистологические срезы изучали под световым микроскопом Optika XDS-2SFL (Италия) с различным увеличением.

Метод статистического анализа включал расчёт описательных статистик (Me – медиана, Q₁ – 25% квартиль, Q₃ –75% квартиль), проверку распределения признака на нормальность, межгрупповое  сравнение  показателей с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия считались статистически значимыми при уровне р<0,05.

Результаты исследования

Проведенные нами ранее исследования в условиях in vitro показали, что индекс клеточной токсичности трехмерных нетканых матриксов на основе полимолочной кислоты соответствует номинальным пределам (70-120 %). Было установлено что, влияние матриксов на жизнеспособность культуры миелокариоцитов (клеток костного мозга) было как прямым контактным, так и опосредовано через продукты биодеградации тестируемых образцов, выделяющиеся из материала при контакте с модельной биологической жидкостью и клеточными ферментами, выделяемыми при культивировании миелокариоцитов [3]. Тестируемый материал также выдержал испытание на апирогенность [4].

Показателем системного воспалительного ответа организма на раздражитель  являются изменения числа и форм лейкоцитов в периферической крови [2]. После подкожного введения тестируемых матриксов установлена выраженная лейкоцитарная реакция крови, обусловленная увеличением (в 1,5 раза по сравнению с контролем) содержания лимфоцитов (таблица). Отсутствие значительного нейтрофилёза крови свидетельствовало об асептическом характере воспаления, протекающего в подкожной клетчатке вокруг тестируемого материала.

Таблица.

Гематологические показатели у крыс после подкожной имплантации гибридного синтетического нетканого матрикса из полимолочной кислоты, Ме (Q₁; Q₃), p

Известно, что лимфоциты являются активными участниками и клетками-регуляторами регенераторных процессов в паренхиматозных органах [1], опосредованных, в том числе, через активацию продуктивного (пролиферативного) воспаления. В этом плане системные реакции организма, зафиксированные по изменениям индексов крови, позволяют считать тестируемый матрикс биоактивным имплантатом, запускающим при местном применении длительное иммунорегуляторное воспаление, связанное с активацией мононуклеарных клеток, опосредующее регенераторные процессы во внутренних органах.

При визуальном осмотре подкожной клетчатки и внутренних органов брюшной и грудной полостей у ложнооперированных крыс не было отмечено изменения цвета, макроскопических признаков асептического воспаления или нагноения. Визуальное состояние органов брюшной и грудной полостей не отличалось на макроскопическом уровне от такового у животных контрольной группы.

У животных опытной группы в правом подмышечном кармане располагался имплантированный матрикс в соединительнотканной оболочке. В 90% случаев через 30 суток после подкожного введения полилактидного матрикса наблюдалась локальная гиперемия и усиление рисунка кровеносного русла на прилегающей к имплантату территории внутренней поверхности кожи. При попытке отделить соединительнотканную капсулу от матрикса было обнаружено, что испытуемое изделие остается прочным, соединительная ткань врастает в его волокнисто-пористую поверхность. Капсула тонкая, предположительно, содержит коллагеновые волокна, поскольку при разрезании происходит ее стягивание и оголение краев матриксов (рисунок 1).

Рисунок 1. Состояние соединительнотканной капсулы вокруг матрикса из полимолочной кислоты через 30 суток после его подкожной имплантации (стрелками отмечена зона интереса)

Микроскопическое исследование также показало пальцеобразное врастание соединительной ткани в структуру полилактидного матрикса, преимущественно с торца тестируемых изделий (рисунок 2).

Рисунок 2. Соединительнотканная капсула вокруг матрикса из полимолочной кислоты (стрелкой отмечено оптически прозрачное вещество матрикса).  Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение: × 400

Клеточный состав врастающей соединительной ткани представлен многочисленными фибробластами и единичными  гигантскими многоядерными клетками инородных тел. Соединительнотканная капсула вокруг матрикса состоит из слоя фибробластоподобных клеток, нескольких колец упорядоченных коллагеновых волокон, ориентированных параллельно поверхности имплантатов, и рыхлой волокнистой соединительной ткани на периферии зоны имплантации. Непосредственно к поверхности имплантата прилежат кровеносные сосуды. В некоторых местах интерстициальная жидкость отделяет соединительнотканную капсулу от поверхности матрикса.  При этом шероховатая поверхность матрикса из полимолочной кислоты выстлана слоем фибробластов. Поверхность соединительной ткани в месте расхождения также неровная, кровеносные капилляры заполнены эритроцитами (рисунок 2).

Описанные изменения свидетельствуют о первоначальном срастании матрикса и соединительной ткани, с последующим образованием локальных отеков, обусловленных, скорее всего, венозной гиперемией. Это может быть связано с развитием пролиферативной реакции соединительной ткани на фоне остаточных явлений экссудативного серозного воспаления на вещество имплантата. 

Заключение

Гибридные синтетические нетканые матриксы из полимолочной кислоты являются биосовместимыми изделиями, обладающими биоактивными свойствами в отношении регенераторных процессов и реакций системы крови при подкожной имплантации лабораторным крысам. Матриксы выдержали испытание, не вызывая отрицательных реакций окружающих тканей живого организма.

Список литературы:

1. Бабаева А.Г. Регенерация и система иммуногенеза. – М.:. Медицина, 1985. – 256 с.
2. Горизонтов П.Д., Белоусова О.И., Федотова М.И. Стресс и система крови. – М.: Медицина, 1983. – 240 с.
3. Динамика in vitro деградации нетканых матриксов из полимолочной кислоты в модельной биологической жидкости / И.А. Хлусов и др. // Бюллетень сибирской медицины. – 2013. – Т. 12, № 6. – С. 73–81.
4. Оценка цитотоксичности и апирогенности биодеградируемого полилактидного матрикса / К.В. Зайцев и др. // Journal of Siberian Medical Sciences. – 2016. – № 4. – С.10.
5. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств [под ред. А.Н. Миронова]. – Ч. 1. –  М.: Гриф и К, 2012. – 944 с.
6. Biomaterials science: an introduction to materials in medicine. 2nd ed. [ed. by B.D. Ratner, A.S. Hoffman, F.J. Schoen, J.E. Lemons]. San Diego: Elsevier Academic Press, 2004. – 851 p.
7. Lee Y.-Sh. Electrospun Nanofibrous Materials for Neural Tissue Engineering / Y.-Sh. Lee, T.L. Arinzeh // Polymers. – 2011. – Vol. 3. – P. 413–426.
8. Nanotechnology for cell-substrate interactions / N.J. Sniadecki et al. // Annals of Biomedical Engineering. – 2006. – Vol. 34. – P. 59–74.
9. Nonwoven polylactide scaffolds obtained by solution blow spinning and the in vitro degradation dynamics / S. Tverdokhlebov et al. // Advanced Materials Research. – 2014. – Vol. 872. – Р. 257–262.