ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ РАДИАЦИОННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ ГАЛОФИЛОВ, ПРЕДСТАВЛЕННЫМИ HALOBACTERIUM SALINARUM 353-П В ПРИСУТСТВИЕ И ОТСУТСТВИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ХИТОЗАНА 12 КДА

АННОТАЦИЯ

В наш век перед человечеством стоит масштабнейшая задача – разработать методы, которые позволять снизить тот вред, который наносится человеческому организму при воздействии на него радиационного излучения. Собственно, именно из-за этой проблемы ученые стремятся разработать целый комплекс мероприятий, которые направлены на повышение радиационной защиты организма путём использования веществ природного происхождения, например, биополимера хитозана на модельных объектах – галобактериях [1-3].

ABSTRACT

In our age, humanity faces a major task – to develop methods that can reduce the harm that is caused to the human body when exposed to radiation. Actually, it is precisely because of this problem that scientists are striving to develop a whole range of measures aimed at increasing the radiation protection of the body by using substances of natural origin, for example, chitosan biopolymer on model objects – halobacteria [1-3].

Введение

Разнообразные среды обитания, которым присущи экстремальные показатели нередко бывают заселенными разнообразнейшими микроорганизмами, приспособившимися к данным условиям обитания. Называются такие микроорганизмы экстремофилами, живущими в экстремальных условиях обитания [4]. В местах, имеющих наибольшие концентрации солей существуют такие организмы - экстремальные галофилы. Самыми исследованными среди экстремальных галофилов являются Halobacterium salinarum, относящиеся к археям. К сожалению, до сих пор выходы биосинтеза клеток целевых продуктов являются чересчур незначительными, так как биотехнологический потенциал экстремальных галофильных микроорганизмов является недостаточно раскрытым [5]. Самому пристальному вниманию ученых подверглась исключительная выживаемость галофилов при достаточно высоких уровнях повреждений, превышающих экстремальные воздействия. Внимание также заслуживает тот факт, что в мембранах галобактерий присутствует бактериородопсин, чье свойство воспринимать свет роднит его с родопсином в клетках человеческих глаз. За счет бактериородопсина у галобактерий имеется способность к фотосинтезу.  Одним из наиболее устойчивых к облучению микроорганизмом является Halobacterium salinarum [6]. Основными факторами, определяющими выживаемость микроорганизмов, являются состояние клеточной стенки, уровень восстановительных эквивалентов, находящихся внутри клетки, присутствие веществ-радиопротекторов. Примером таких веществ является хитозан.

Хитозан — «аминосахар, производное линейного полисахарида, макромолекулы состоят из случайно связанных β-(1-4) D-глюкозаминовых звеньев и N-ацетил-D-глюкозамин. Хитозан — катионный полисахарид основного характера. На сегодня достигнут уровень очистки до 85 %» [7].

Рисунок 1. Молекула хитозана

Так же хитозан может спокойно удерживать ионы разных металлов (радиоактивные и других токсичных).  Хитозан малорастворим в водной среде. Из-за эффекта молекулярного сита и гидрофобных взаимодействий, хитозан может связывать предельные углеводороды, жиры и жирорастворимые соединения.

Большое количество полезных для человека свойств хитозан имеет из-за присутствия в его структурной формуле огромного количества функциональных групп [8].

Наиболее характерным и стоящим механизмом сорбции на хитиновых и хитозановых макромолекулах является хелатный, следующее по значимости – адсорбционное осаждение нерастворимых солей металлов [9].

Экспериментальные результаты

Концентрации реагентов в смеси для выращивания галобактерий: NaCl – 250г/л, MgSO₄*7H₂O – 20г/л, KCl – 3г/л, Na₃C₆H₅O₇ – 3г/л, Триптон-Б – 5г/л, Bacto BD – 2г/л, Глицерин (353-П) – 1мл/л = 1,25г/л.

Облучение проводилось в РХТУ им. Д.И. Менделеева на факультете ИМСЭН-ИФХ на рентгеновском аппарате с мощностью поглощенной дозы 3 Гр/с и рабочими параметрами рентгеновской трубки 50 мА, 40 кВ по дозиметру Фрикке, диапазон доз до 10 кГр [10].

В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца из 2 последних разведений (степень разведения зависит от количества КОЕ в 1 дозе исследуемого препарата) по 0,1 мл микробной суспензии высевают на чашки Петри с питательной средой (по 2 чашки на каждое разведение). Суспензию равномерно распределяют по поверхности среды шпателем Дригальского или с помощью стеклянных бус до полного впитывания (высыхания) суспензии. Чашки закрывают и помещают перевернутыми вверх дном в термостат для инкубации.

Посевы инкубируют при температуре (37 ± 1) ^оС в течение 24–96 ч в адекватных, в зависимости от вида микроорганизмов, условиях (аэробных, микроаэрофильных или анаэробных), что показано на рис.2.

Рисунок 2. Чашка Петри с выросшими колониями галобактерий

На основании данных, полученных с рис.2 и аналогичных чашек Петри по нижеуказанным формулам, были рассчитаны колониеобразующие единицы (КОЕ) для каждого разбавления: N=((a±2δ_A)K)/V

δ_A=±√((∑a)/n)

N – количество галобактерий, колониеобразующие единицы,

a – среднее количество колоний,

δ_A – погрешность,

K – коэффициент разбавления,

V – объём раствора в носике для пересадки,

n – количество точек

На рис. 3 и рис. 4 представлены зависимости выживаемости галобактерий от поглощенной дозы, проанализировав которые нам станет ясно, что кривая выживаемости галобактерий с добавленным хитозаном является более плавной, что говорит о лучшей сопротивляемости галофилов излучению. К тому же, анализируя количество КОЕ, можно говорить о том, что добавление хитозана повысило количество выживших галобактерий. В свою очередь, на рис.5 мы видим иную картину. Добавление заранее облученного дозой 6 кГр хитозана в колбу с последующим культивированием и облучением повлияло на радиопротекторный механизм хитозана. Галофилы выживали вплоть до облучения дозой 10 кГр, но пик выживаемости пришелся на 2 кГр, вслед за которым идёт плавное снижение.

Рисунок 3. Зависимость выживаемости галобактерий (без добавления хитозана при культивировании 2 недели) от поглощенной дозы

Рисунок 4. Зависимость выживаемости галобактерий (с добавления хитозана при культивировании 2 недели) от поглощенной дозы

Рисунок 5. Зависимость выживаемости галобактерий (без добавления хитозана при культивировании 2 недели) от поглощенной дозы

Антиоксидантные свойства хитозана после облучения увеличиваются за счёт распада его полимерной цепи на множество олигомеров, сохраняющих антирадикальные свойства, благодаря возникновению новых связей и сохранению свободных аминогрупп. Также возникает возможность образовывать большее количество водородных связей, таким образом улучшая способность к присоединению водорастворимых органических веществ.

Хитозан помог выжить галобактериям при высоких дозах облучения за счет своего механизма радиопротекторного действия, суть которого заключается в сорбции вредных для клеток ионов (например, H⁺, OH^-, HOO^-), образовавшихся в процессе радиолиза, на свои функциональные группы, вследствие чего часть клеток выживает. За счет своей структуры он способен удерживать не только растворитель, но и растворенные в нем вещества.

Выводы

1. Хитозан протектирует способность к выживаемости галобактерий при облучении рентгеновскими лучами: без хитозана – до 800 Гр, с хитозаном – от 2000 Гр до 4000 Гр.

2. Предварительно облученный хитозан, внесённый в среду культивирования галобактерий, повысил выживаемость последних при облучении рентгеновскими лучами до 10000 Гр.

Список литературы:

1. Бабанов Н. и др. Ядерная энергетика, человек и окружающая среда; под ред. акад. А. Александрова // Н. Бабаев. 2-е изд., перераб, и доп. М.: Энергоатомиздат. - 1998. – 235с.
2. В. М. Бяков, С. В. Степанов. К механизму первичного биологического действия ионизирующих излучений // Успехи физических наук. - 2006. Т.176, вып.5. С. 487–506.
3. Варламов В.П., Ильина А.В., Шагдарова Б.Ц., Луньков А.П., Мысякина И.С. Хитин/Хитозан и его производные: Фундаментальные и прикладные аспекты. // Успехи биологической химии. – 2020. Т.60. С. 317–368.
4. DasSarma, S., B.R. Berquist, J.A. Coker, P. DasSarma, J.A. Müller. Post-genomics of the model haloarchaeon Halobacterium sp. NRC-1, 2006.
5. Калёнов, С.В. Культивирование дрожжей и галобактерий в условиях контролируемого окислительного стресса: дисс. … канд. биол. наук – М., 2007. – 20 с.
6. I.I. Ignatov, O.V. Mosin. Studying the Mechanism of Phototransformation of Light Signal by Various Mammal and Bacterial Photoreceptor Pigments: Rhodopsyne, Iodopsyne and Bacteriorhodopsyne // European Journal of Molecular Biotechnology - 2015. Т.8, вып.2. С. 63-79.
7. Нормы радиационной безопасности (НРБ-99/2009) // Минздрав России. - 2009.
8. Пикаев А.К. Современное состояние радиационной технологии // Успехи химии. - 1995. Т.64, вып.6. С. 569–598.
9. Скрябин К., Тихонович И., Варламов В. Хитозан – полимер с уникальными свойствами // Наука в России. - 2014. Вып.6. С. 4-12.
10. Чалых А.Е., Петрова Т.Ф., Хасбиуллин Р.Р., Озёрин А.Н. Сорбция и диффузия воды в хитинах и хитозанах // Наука. - 2014. Т.56, вып.5. С. 526-536.