АНАЛИЗ  АССОЦИАЦИИ  ПОЛИМОРФИЗМА  ГЕНА  IL-4  (C590T)  С  ВОЗНИКНОВЕНИЕМ  БРОНХИАЛЬНОЙ  АСТМЫ  У  ДЕТЕЙ

Щаюк  Анна  Николаевна

студент  5  курса,  кафедра  генетики  биологического  факультета  БГУ,  г.  Минск

E-mail: 

Крупнова  Эвелина  Вячеславовна

научный  руководитель,  канд.  биол.  наук,  доцент,  ГНУ  «Институт  генетики  и  цитологии  НАН  Беларуси»,  г.  Минск

Атопическая  бронхиальная  астма  (БА)  —  одно  из  наиболее  распространенных  и  тяжелых  мультифакторных  заболеваний.  По  социально-экономическому  ущербу,  влиянию  на  уровень  здоровья  и  качество  жизни  пациентов,  бронхиальная  астма  входит  в  число  одних  из  основных  патологий  в  структуре  заболеваний  человека  [1;  3].  Эта  болезнь  является  следствием  аллергической  реакции  и  обусловлена  смежным  взаимодействием  иммунокомпетентных  клеток,  медиаторов,  клеток  и  тканей  бронхов,  приводящим  к  отеку  бронхиальной  стенки,  гиперсекреции  и  перестройке  бронхиального  дерева  [7;  15]. 

Особо  важную  роль  в  реализации  атопических  реакций  играют  цитокины  —  внеклеточные  протеины  или  гликопротеины,  которые  необходимы  для  межклеточных  взаимодействий.  Они  обеспечивают  передачу  сигнала  между  клетками,  связываясь  с  соответствующими  рецепторами  на  поверхности  клеток-мишеней.  Цитокины  воздействуют  на  клетки  и  вызывают  активацию  их  пролиферации,  синтеза  и  высвобождения  других  цитокинов  и  медиаторов,  а  также  стимулируют  рост,  дифференцировку  и  апоптоз  различных  клеток  иммунной  системы  [5;  6].

Раскрытие  деталей  этиологии  и  патогенеза  БА  привело  к  пониманию  важной  роли  в  этих  процессах  интерлейкинов,  которые  ответственны  за  индукцию  и  поддержание  воспаления  при  данном  заболевании.  Интерлейкины  участвуют  в  формировании,  контроле  и  регуляции  воспалительного  процесса  в  дыхательных  путях.  Гены  этих  цитокинов  расположены  тандемно  в  одном  кластере  на  хромосоме  5q31-33  [8;  14].  Данный  локус  рассматривается  как  один  из  «кандидатов»,  определяющих  развитие  БА.

Интерлейкин  4  (IL-4)  является  ключевым  цитокином  в  развитии  аллергического  воспаления.  Известно,  что  полиморфизм  гена  IL-4  в  промоторной  области  С590Т  приводит  к  усилению  промоторной  активности  гена  и  повышению  концентрации  сывороточного  IgE  [2;  12;  13].

Целью  исследования  явилось  изучение  ассоциации  полиморфного  варианта  гена  IL-4  (C590T)  с  риском  возникновения  атопической  БА  у  детей,  проживающих  в  Республике  Беларусь.

Материалы  и  методы

Обследован  231  ребенок  (162  мальчика  и  69  девочек)  в  возрасте  от  3  до  18  лет,  страдающих  атопической  бронхиальной  астмой,  находившихся  на  лечении  в  УЗ  «4-ая  городская  детская  клиническая  больница»  г.  Минска.  Всем  пациентам  был  поставлен  диагноз  «атопическая  бронхиальная  астма»  на  основании  клинических  проявлений  и  результатов  биохимических  исследований.  В  контрольную  выборку  вошли  111  человек  (55  мальчиков  и  56  девочек)  без  признаков  аллергической  патологии  соответствующего  пола  и  возраста.

Выделение  ДНК  из  периферической  крови  проводили  по  методике,  описанной  Mathew  [11].  В  ходе  выполнения  работы  методом  полимеразной  цепной  реакции  (ПЦР)  и  методом  анализа  полиморфизма  длин  рестрикционных  фрагментов  (ПДРФ)  был  исследован  полиморфизм  гена  IL-4  (C590T).  ПЦР  проводили  на  амплификаторе  MyCyclerTM  Termal  cycler  «BIORAD»,  США.  Праймеры,  использованные  в  работе:  F:5'-ACTAGGCCTCACCTGATACG-3',  R:5'-GTTGTAATGCAGTCCTCCTG-3'.  Условия  проведения  ПЦР:  94˚  —  5;  (94˚  —  30΄΄,  60˚  —  30΄΄,  72˚  —  30΄΄)  —  32  цикла;  72˚  —  5΄;  4˚  —  ∞  [9]. 

Для  изучения  полиморфизма  IL-4  (C590T)  в  области  промотора  гена  IL-4  амплифицированый  фрагмент  длиной  254  п.  н.  подвергали  рестрикционному  расщеплению  эндонуклеазой  BsmFI.  Продукты  рестрикции  фракционировали  в  2,0  %  агарозном  геле  и  визуализировали  в  УФ-свете.  Генотипы  IL-4  идентифицировали  по  длине  полученных  в  ходе  рестрикции  фрагментов:

CC  (210  п.  н.+  44  п.  н.);  CT  (254  п.  н.+  210  п.  н.+  44  п.  н.);  TT  (254  п.  н.).

Статистическая  обработка  данных  проводилась  с  использованием  пакета  прикладных  программ  “Statistica  for  Windows  6.0”.  При  сравнении  частот  генотипов  использовался  стандартный  критерий  c²  Пирсона.  Об  ассоциации  генотипов  с  предрасположенностью  к  БА  судили  по  величине  отношения  шансов  (odds  ratio,  ОR)  —  показателю,  показывающему,  во  сколько  раз  вероятность  оказаться  в  группе  «случай»  (больные)  отличается  от  вероятности  оказаться  в  группе  «контроль»  (здоровые)  для  носителя  изучаемого  генотипа.  Величину  отношения  шансов  рассчитывали  по  стандартной  формуле  ОR=(A/B)/(C/D),  где  A  и  B  —  количество  больных,  имеющих  и  не  имеющих  мутантный  генотип,  соответственно,  и  C  и  D  —  количество  человек  в  контрольной  группе,  имеющих  и  не  имеющих  мутантный  генотип.  При  OR=1  ассоциация  отсутствовала,  OR>1  рассматривали  как  положительную  ассоциацию  заболевания  с  исследуемым  генотипом  («фактор  риска»)  и  OR<1  —  как  отрицательную  ассоциацию  («фактор  устойчивости»).  OR  указан  с  95  %-ным  доверительным  интервалом.

Результаты  и  обсуждение

Разработка  современных  достоверных  методов,  позволяющих  диагностировать  БА  на  раннем  этапе  развития,  формировать  группы  риска  с  целью  проведения  первичной  профилактики  развития  БА,  а  также  прогнозировать  особенности  течения  этих  заболеваний,  является  одной  из  актуальных  проблем  биологии  и  медицины.  Перспективными  для  этих  целей  являются  исследования,  посвященные  изучению  генетических  основ  БА.  Сравнение  частоты  встречаемости  отдельных  аллелей  и  генотипов  у  больных  БА  дает  возможность  составить  представление  о  сходстве  или  различии  изучаемых  генетических  особенностей  в  исследованных  группах  при  этом  заболевании.

Для  выяснения  ассоциации  полиморфизма  изучаемого  гена  с  риском  возникновения  атопической  БА  проводили  сравнительный  молекулярно-генетический  анализ  распределений  частоты  встречаемости  полиморфных  генотипов  в  группах  пациентов  с  контролем.  Результаты  анализа  распределения  частоты  полиморфных  вариантов  гена  IL-4  у  детей,  больных  БА  и  в  контрольной  группе  представлены  в  таблице  1.

Таблица  1.

Распределение  частот  встречаемости  генотипов  IL-4  в  группе  больных  БА  и  в  контрольной  группе

Примечание:  *  —  p=0,022,  р  —  уровень  значимости  различий  по  критерию  c²  с  контрольной  группой;  **  —  p=0,033,  р  —  уровень  значимости  различий  по  критерию  c²  с  контрольной  группой

Согласно  полученным  данным  обнаружено,  что  в  контрольной  группе  генотип  590СС  встречается  достоверно  чаще,  чем  в  объединенной  группе  больных  атопической  БА  (ОR=0,56;  95  %CI:  0,36—0,9),  что  говорит  о  значительной  роли  данного  генотипа  в  защитных  процессах  организма  в  отношении  риска  возникновения  БА.  В  группе  больных  БА  отмечено  увеличение  частоты  генотипа  590ТТ  в  7,7  раза  по  сравнению  с  контрольной  группой  (ОR=8,19;  95  %CI:  1,07—62,54),  т.  е.  у  носителей  этого  генотипа  (590ТТ)  повышен  риск  возникновения  БА.

Так  как,  в  группе  исследованных  больных  атопической  БА  встречались  различные  формы  этого  заболевания,  то  проводился  сравнительный  молекулярно-генетический  анализ  распределений  частот  встречаемости  полиморфных  генотипов  IL-4  в  следующих  группах  больных:  изолированная  форма  БА;  БА  и  аллергический  ринит  (АР);  БА  и  атопический  дерматит  (АД);  БА  с  аллергическим  ринитом  и  атопическим  дерматитом. 

Группа  пациентов  с  изолированной  формой  бронхиальной  астмы  составляет  32,9  %  из  больных  атопической  БА.  При  анализе  распределения  частоты  встречаемости  полиморфных  генотипов  IL-4  у  этих  больных  (таблица  2)  было  также  выявлено  достоверно  значимое  отличие  частоты  встречаемости  генотипа  590СС:  в  контрольной  группе  данный  генотип  встречается  в  1,3  раза  чаще,  чем  в  группе  больных  с  изолированной  формой  БА  (ОR=0,47;  95  %CI:  0,26—0,86).  Исходя  из  результатов  анализа,  полученных  в  группе  больных  атопической  БА  и  группе  больных  с  изолированной  формой  БА,  данный  генотип  играет  важную  роль  в  защитных  процессах  организма  в  отношении  риска  возникновения  БА.

Таблица  2.

Распределение  частот  встречаемости  генотипов  IL-4  у  больных  с  изолированной  формой  БА  и  в  контрольной  группе

Примечание:  *  —  p=0,021,  р  —  уровень  значимости  различий  по  критерию  c²  с  контрольной  группой

Наиболее  распространенным  сочетанием  является  БА  и  АР,  составляющим  42,4  %  из  общей  группы  больных  БА  (таблица  3).  Для  этой  группы  показано  статистически  значимое  отличие  частоты  встречаемости  генотипа  590TT:  в  группе  больных  он  встречается  в  10  раз  чаще,  чем  в  контрольной  группе  (ОR=11,12;  95  %CI:  1,38—89,47).  Этот  генотип  имеет  рисковую  значимость  в  отношении  риска  возникновения  БА,  сочетанной  с  АР.

Атопическая  БА,  сочетанная  с  АД,  встречается  реже  (6,9  %  из  общей  группы  больных  БА).  При  анализе  распределения  частоты  полиморфных  генотипов  IL-4  в  этой  группе  достоверно  значимых  отличий  обнаружено  не  было  (таблица  3).

Таблица  3.

Распределение  генотипов  IL-4  у  больных  БА,  сочетанной  с  АР  и  с  АД,  и  в  контрольной  группе

Примечание:  *  —  p=0,013,  р  —  уровень  значимости  различий  по  критерию  c²  с  контрольной  группой

Частота  встречаемости  БА,  сочетанной  с  АР  и  АД,  составляет  14,7  %  от  общего  числа  больных  БА.  Анализ  распределения  частоты  полиморфных  генотипов  IL-4  в  этой  группе  не  показал  статистически  значимых  отличий  от  контрольной  группы  (таблица  4).

Таблица  4.

Распределение  частот  встречаемости  генотипов  IL-4  у  больных  БА,  сочетанной  с  АР  и  АД,  и  в  контрольной  группе

Таким  образом,  исследование  полиморфных  вариантов  гена  IL-4  c  риском  возникновения  атопической  бронхиальной  астмы  показало,  что:

1.  генотип  590ТТ  ассоциирован  с  риском  возникновения  этой  патологии;

2.  генотип  590  СС  играет  защитную  роль  в  отношении  риска  возникновения  БА.

Работа  выполнялась  в  рамках  ГПНИ  «Фундаментальные  основы  биотехнологий  (Геномика)»  совместно  с  сотрудниками  4-ой  городской  детской  клинической  больницы  г.  Минска.

Список  литературы:

1. Балаболкин  И.И.  Современная  концепция  патогенеза  бронхиальной  астмы  у  детей  //  Иммунология,  аллергология,  инфектология,  2006,  №  1.  —  С.  26—35.
2. Берсимбай  Р.И.,  Роль  полиморфизма  генов  в  предрасположенности  к  бронхиальной  астме  и  хронической  обструктивной  болезни  легких  //  Вестник  ЕНУ  им.  Л.Н.  Гумилева,  2010,  №  1.  —  С.  401—411.
3. Давидовская  Е.И.  Бронхиальная  астма  сегодня  —  проблемы  и  решения  /  Е.И.  Давидовская,  Т.В.  Барановская  —  Мн.  :  БелМАПО,  2006.  —  13  с.
4. Даниляк  И.Г.  Бронхиальная  астма.  Практическое  пособие  для  терапевтов  /  И.Г.  Даниляк,  А.Д.  Пальман  —  М.:  НЬЮДИАМЕД,  2009.  —  68  с.
5. Кетлинский  С.А.  Роль  Т-хелперов  1  и  2  в  регуляции  клеточного  и  гуморального  иммунитета  //  Иммунология.  2003.  №  2.  —  С.  77—79.
6. Манина  И.В.  Иммунопатология  и  биохимические  основы  терапии  атопических  состояний  //  Лечащий  врач,  март  2012,  №  3.  [Электронный  есурс]  —  Режим  доступа.  —  URL:  http://apteka-club.ru/uploads/articles/tavegil/Manina_Klimastin.pdf  (дата  обращения  27.03.2013).
7. Фрейдин  М.Б.,  Генетика  атопии:  современное  состояние  //  Вестник  ВОГиС,  2006.  Том  10.  —  №  3.  —  C.  492—502.
8. Arai  K.I.  Cytokines:  coordinators  of  immune  and  inflammatory  responses  //  Ann.  Rev.  Biochem.,  1990.  —  V.  59.  —  P.  783—802.
9. Li  H.  Single-Nucleotide  Polymorphisms  in  Genes  Predisposing  to  Asthma  in  Children  of  Chinese  Han  Nationality  //  J  Investig  Allergol  Clin  Immunol,  2009;  V.  19  (5).  —  Р.  391—395.
10. Malerba  G.  A  review  of  asthma  genetics:  gene  expression  studies  and  recent  candidates  /  G.  Malerba,  P.F.  Pignatti  //  Genet  46  (1).  —  2005.  —  Р.  93—104.
11. Mathew  C.C.  The  isolation  of  high  molecular  weight  eucaryotic  DNA  //  in  Walker  JMNJ  (ed):  Methods  in  Molecular  Biology,  Clifton:  Human  Press,  1984.  —  Vol.  2.  —  P.  31—34.
12. Rockman  M.V.  Positive  selection  on  a  human-specific  transcription  factor  binding  site  regulating  IL-4  expression  //  Curr  Biol.,  2003.  —  V.  13  (23).  —  P.  2118—2123.
13. Rosenwasser  L.J.  Genetics  of  atopy  and  asthma  —  promoter-based  candidate  gene  studies  for  IL-4  //  International  archives  of  allergy  and  immunology,  1997.  —  V.  113.  —  P.  61—64. 
14. Walley  A.J.,  Cookson  W.O.  Investigation  of  an  interleukin-4  promoter  polymorphism  for  associations  with  asthma  and  atopy  //  J  Med  Genet.,  1996.  —  V.  33  (8).  —  Р.  689—692.
15. Weiss  S.T.,  Gold  D.R.  Gender  differences  in  asthma  //  Pediatr.  Pulmonol.,  1995.  —  V.  19.  —  P.  153—155.