ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА ИФН-Γ RS 2430561 В РАЗВИТИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ АУТОИММУННОГО ХАРАКТЕРА

Актуальность исследования: центральным звеном патогенеза аутоиммунных заболеваний щитовидной железы является Т-клеточная иммунная агрессия. Одну из ключевых ролей в патогенезе играют аутоантитела к рецепторам тиреотропного гормона (ТТГ) [1]. В частности, стимулирующий Th1 – иммунный ответ IFNγ имеет провоспалительную активность, является важным координатором иммунологического процесса, его аутоиммунной компонентой: увеличивает экспрессию HLAI, II класса и некоторых адгезионных молекул на тироцитах, включая внутриклеточные адгезионные молекулы I (ICAM1) и лимфоцитарный функционально-ассоциированный антиген-3 (LFA3) [2, 3]. Ранее была высказана гипотеза об ассоциации между полиморфизмом гена гамма-интерферона (IFNγ) и аутоиммунным ответом при болезни Грейвса [4, 5]. Целью данного исследования являлось оценка влияния генетического полиморфизма IFNγ T874A, rs2430561, в развитии аутоиммунных заболеваний щитовидной железы.

Цель исследования: исследовать роль аллельного полиморфизма гена IFNγ T874A, rs 2430561, в развитии заболеваний щитовидной железы у жителей Новосибирской области.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Определить частоты встречаемости аллеля и генотипов в группе больных аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы и в контрольной группе (IFNγ, rs2430561);
2. Выполнить статистическую обработку полученных данных.

Материалы: в выборку были включены 119 пациентов, среди них 13 мужчин (15,47 %), 106 женщин (84,53 %). Их средний возраст составил 39,61±15,09 лет. Данные пациенты проходили клиническое обследование в ООО «Инвитро» по поводу различных заболеваний щитовидной железы, среди которых превалирующим являлось состояние эутиреоза и субклинического гипотиреоза. В контрольную группу были включены 313 человек (126 мужчины и 187 женщины, средний возраст 45,23 ± 15,99 лет). Молекулярно-генетическое исследование проводилось на базе Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН.

Методы: Для выделения ДНК использовали метод фенол - хлороформной экстракции. Типирование полиморфного локуса rs2430561 гена IFNγ T874A проводили методом Real-time ПЦР с использованием технологии конкурирующих TaqMan-зондов (структура олигонуклеотидных праймеров и зондов приведена в Таблице1).

Таблица 1.

Структура олигонуклеотидных праймеров.

Каждый образец амплифицировался с использованием пары специфических праймеров и двух пар зондов. Общий объем реакционной смеси составлял 25 мкл, смесь содержала 65 mM Tris–HCl (pH 8.9), 16 mM (NH4)2SO4, 0.05 % Tween 20, 2.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 0,3 μM праймеры, 0,1 μM зонд, 1 ед. акт. TaqDNA полимеразы, 1–10 ng ДНК. Амплификация проводилась с помощью амплификатора CFX 96 (Bio-Rad, США) в следующих условиях: начальная денатурация 3мин при 96°С; затем 49 циклов, включающих денатурацию при 96°С-10 сек, отжиг праймеров и последующую элонгацию при 60°С- 40 сек, с последующим съемом флуоресценции.

Соответствие частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга проверяли по критерию χ². Вычисление проводили с помощью программы DeFinetti на сайте Института генетики человека (Мюнхен, Германия). Адрес свободного доступа http://ihg.gsf.de/cgi-bin/hw/hwa1.pl. В этом случае и при использовании других критериев нулевую гипотезу отвергали при P≤0,05. Силу ассоциации анализируемых признаков определяли с помощью величины отношения шансов (OR). Для OR рассчитывали доверительный интервал (CI) при 95 % уровне значимости.

Результаты и их обсуждения: IFN-γ считается главным кандидатом среди цитокинов на ключевую роль в инициировании развития заболеваний щитовидной железы аутоиммунного характера. Известно об участии IFN-γ в регуляции продукции ауто-антител. Помимо этого, IFN-γ модулирует функционирование и пролиферацию фолликулярных клеток щитовидной железы, способствует индукции экспрессии молекул HLA-II класса. Лимфоциты больных диффузным токсическим зобом (ДТЗ) секретируют больше IFN-γ, чем лимфоциты здоровых лиц, что подтверждает наличие процессов сенсибилизации при данной форме патологии. Повышенная секреция IFN-γ остается у больных ДТЗ и после снятия тиреотоксикоза, свидетельствуя о сохраняющихся у них нарушениях в иммунной системе. Доказано, у пациентов с диагнозом ДТЗ с высокой концентрацией антител к тиреопероксидазе (АТ к ТПО) уровень IFN-γ-мРНК выше, чем у пациентов, уровень АТ к ТПО которых имел низкие значения. Наиболее высокие уровни IFN-γ-мРНК определялись у больных аутоиммунным тиреоидитом, в отличие от пациентов с узловым зобом, у которых содержание цитокинов оказалось самым низким.

У человека ген, кодирующий INF-γ, расположен в 12-й хромосоме в области q15. Известен полиморфный вариант в промоторном регионе гена IFNγ - T874A (rs2430561), который по разным исследованиям ассоциирован с туберкулезом легких [2], аллергическим вульвовагинитом [6], острым инфарктом миокарда [1].

Анализируя представленность аллеля исследуемого гена по данным базы данных (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/), можно сделать предположение о том, что популяция европеоидов является более вероятной носительницей аллеля, ассоциированного с возможным развитием аутоиммунного заболевания щитовидной железы (Таблица 2).

Таблица 2.

Представленность аллеля в разных популяциях

Нами было проведено типирование полиморфного локуса rs2430561 гена INF-γ T874A на выборке здоровых жителей Западно-Сибирского региона, а также больных с заболеванием щитовидной железы, с помощью ПЦР в режиме реального времени и технологии TaqMan (Таблица 3). Результаты интерпретировали исходя из анализа графиков накопления флюоресценции. Основным параметром, который учитывается для каждой из реакций, является соотношение значений флюоресценции (relative fluorescence unit, или RFU) в диапазонах эмиссии красителей FAM и HEX. В случае если интенсивность флюоресценции преимущественно увеличивается в диапазоне одного из красителей, то образец является гомозиготным по аллелю, соответствующему зонду с данным красителем. При гетерозиготном генотипе интенсивность флюоресценции увеличивается равнозначно в обоих диапазонах. Важным критерием достоверности генотипирования служила кластеризация генотипов в группы, строившаяся на основе показателей интенсивности флюоресценции (в относительных единицах флюоресценции - RFU). Кластеризация генотипов в группы приведена на рисунке 1.

Рисунок 1. Кластеризация генотипов, построенная по результатам генотипирования полиморфного локуса rs2430561 гена IFNγ.

Результаты по частотам встречаемости генотипов полиморфного локуса rs2430561 гена IFNγ соответствует закону Харди-Вайнберга во всех сформированных нами группах (больных и контрольной группе). Риск развития заболевания щитовидной железы для пациентов с генотипом АА (OR=1.363, CI=[1.011-1.838], p=0,04).

Таблица 3.

Результаты типирования полиморфного локуса rs2430561 гена T874A на выборке исследуемой группы и здоровых жителей Новосибирской области.

Примечание. HWE p — уровень статистической значимости соответствия частот генотипов закону распределения Харди—Вайнберга (Hardy—Weinbergequilibrium)

Выводы: Определены частоты встречаемости аллеля и генотипов в группе больных аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы и в контрольной группе (IFNγ, rs2430561). Частоты встречаемости генотипов для всех исследуемых полиморфных локусов соответствовали закону Харди-Вайнберга. Наличие мутации в гене IFNγ (rs 2430561, T874A) в 1,363 раза повышает риск возникновения заболеваний щитовидной железы. С другой стороны, уровень достоверности низкий, для увеличения достоверности и подтверждения наличия эффекта полиморфизма необходимо увеличивать размер выборки.

Список, литературы:

1. Барсова Р. М. Комплексный анализ генетической предрасположенности к инфаркту миокарда: Автореф. дис. канд. мед. наук. – Москва, 2013. – 25 с.
2. Воронкова, О. В., Новицкий, В. В., Некрасов, Е. В., Филинюк, О. В., Чурина Е. Г., Михеева К. О., Хасанова Р. Р., Серебрякова В. А.,  Сухаленцева Н. А. Аллельный полиморфизм гена IFN γ при туберкулезе легких. // Медицинская иммунология. - 2010. – Т. 12. – № 3. – С. 259–264.
3. Павлова А. А. Хронический вульвовагинит, ассоциированный с аллергией: принципы дигностики и терапии: Дис. на соис. уч. степ. канд. мед. наук. – Москва, 2016. – 130 с.
4. Саприна Т. В., Прохоренко Т. С., Рязанцева Н. В.,  Ворожцова И. Н. Цитокинопосредованные механизмы формирования аутоиммунных тиреопатий. // Клиническая и Экспериментальная Тиреодология. – 2010. – Т. 4. – № 6. – С. 22–33.
5. Antonelli A., Ferrari S. M., Corrado A., Di Domenicantonio A. and Fallahi P. Autoimmune thyroid disorders. // Autoimmun. Rev. – 2015. – Vol. 14. – N. 2. – P. 174–180.
6. Anvari M., Khalilzadeh O., Esteghamati A., Momen-Heravi F., Mahmoudi M., Esfahani S. A., Rashidi, A. and Amirzargar A. Graves’ disease and gene polymorphism of TNF-α, IL-2, IL-6, IL-12, and IFN-γ. // Endocrine. – 2010. – Vol. 37. – N. 2. – P. 344–348.
7. Bassi V., Vitale M., Feliciello A., De Riu S., Rossi G., Adhesion G. F. Molecule-l Carcinoma Cell. // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 1995. – Vol. 80. – N. 4. – P. 1129–1135.
8. Bagnasco M., Pesce G. P., Caretto A., Paolieri F., Pronzato C., Villaggio B., Giordano C., Betterle C. and Canonica, G. W. Follicular thyroid cells of autoimmune thyroiditis may coexpress ICAM-1 (CD54) and its natural ligand LFA-1 (CD11a/CD18). // J. Allergy Clin. Immunol. – 1995. – Vol. 95. – N. 5. – P. 1036–1043.