МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ ПО БИУРЕТОВОЙ РЕАКЦИИ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

Белки играют важную роль, поскольку являются самой главной составной частью клеток всех органов и тканей организмов. В литературе описаны различные способы качественного и количественного определения белков, имеющие разную степень погрешности и сложности исполнения. Поэтому количественное определение белка экспрессными, точными и дешевыми методами является актуальной задачей аналитических исследований. В современной аналитической химии сегодня большое внимание уделяется таким метрологическим оценки методов анализа таким как: открываемый минимум, абсолютная и относительная погрешности измерения и их изменение при модификации методик, которые часто используются как в научных, так и в заводских лабораториях.

Цель работы заключается в осуществлении метрологической оценки количественного определения белка при помощи биуретовой реакции, ее модификации.

Определение открываемого минимума.

Биуретовая реакция является цветной универсальной реакцией на белки, дающей фиолетовый комплекс двухвалетной меди с атомами, входящих в пептидную связь белка [3, с 4].

Измерение открываемого минимума биуретовой реакции проводилось методом разбавления стандартного раствора белка с фиксированием значений оптической плотности на спектрофотометре ССП 310 при 540 нм. Эксперимент продолжался до сравнивания значений оптической плотности нулевого и исследуемого раствора. Результаты опыта представлены на рисунке 1.

Рисунок 1. Открываемый минимум биуретовой реакции

Открываемый минимум биуретовой реакции равен 0,016 мг/мл.

Сравнение модифицированной и классической методик. Модификация методики приготовления биуретового реактива заключалась в отсутствии KI, в то время как «классический» биуретовый реактив готовится с добавлением йодистого калия. Сравнение классической и модифицированной методики проводилось параллельно с использованием стандартного раствора белка и добавлением его в исследуемые растворы с концентрацией 2 мг/мл. Оптические плотности этих растворов попарно измерялись на спектрофотометре ССП 310 при длине волны равной 540 нм. Спустя некоторые промежутки времени растворы обновлялись: добавлялись новые порции обычного и модифицированного биуретового реактива к стандартному раствору белка. Проведенные семь повторений с экспозицией по 260 мин, позволили создать выборочные средние значения изменений концентраций белка для двух методик и рассчитать для каждого ее стандартного отклонения от добавленной при каждом опыте концентрации белка. Так же были проведены сравнения методик по критерию Фишера: дисперсии концентраций для каждого отрезка времени двух методик воспроизводимы и не выходят в критическую область. Результаты эксперимента представлены на рисунке 2.

Рисунок 2. Изменение концентрации яичного альбумина от времени

На рисунке 2 представлено выборочное среднее изменение концентраций белка, с использованием разных методик, относительно времени получения оптических плотностей. На нем так же нанесены стандартные отклонения значений каждой из методик: стандартное отклонение классического метода (S с KI) равно ±0,0137 мг/мл, в то время как стандартное отклонение модифицированной методики (S без KI) равно ±0,0246 мг/мл [1, c. 17].

Устойчивость калибровочной зависимости. В продолжение исследования были выявлены метрологические характеристики устойчивости калибровочной зависимости биуретовой реакции во времени. Была составлена калибровочная зависимость на спектрофотометре ССП 310 при длине волны 540 нм, которая выдерживалась в течение 480 мин. Используемые концентрации в калибровочной зависимости: 0,25; 0,75; 1,25 и 1,75 мг/мл. Образцы при этом не обновлялись, фиксировались только оптические плотности растворов относительно времени. На основании полученных значений, которые представлены на рисунке 3, рассчитаны метрологические характеристики (s-дисперсии, квантили t-распределения, уравнения линии тренда). Для наглядности разброса значений был построен «коридор ошибок» для каждой концентрации белка, равной оптическим плотностям калибровочной прямой. «Коридор ошибок» представлен на рисунке 4 [1, c. 55].

Рисунок 3. Зависимость оптической плотности растворов белка от времени

Рисунок 4. Коридор ошибок

В ходе исследования было установлено, что открываемый минимум биуретового спектрофотометрического метода определения без учета инструментальной погрешности равен 0,016 мг/мл.

Проведено сравнение стандартных отклонений каждой из методик: стандартное отклонение классического метода (S с KI) равно ±0,0137 мг/мл, в то время как стандартное отклонение модифицированной методики (S без KI) равно ±0,0246 мг/мл. Исходя из этого, точность модификации метода хуже в сравнении с точностью распределения значений классической методики приготовления биуретового реактива.

Для больших концентраций для уменьшения систематической ошибки необходима выдержка калибровочной зависимости в течении одного часа после приготовления биуретового реактива.

Увеличение концентрации яичного альбумина от нулевой точки калибровочного графика с увеличением экспозиции растет систематическая ошибка калибровочной зависимости.

Список литературы:

1. Беляев А.П. Физическая и коллоидная химия. Практикум обработки экспериментальных результатов: учебное пособие. M.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. 112 с.
2. Друцы В.Л., Королева О.Н. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991, 544 с.
3. Петров О.А., Пуховская С.Г. Практикум по биохимии: методические указания. Иваново: Ивановский государственный химико-технологический университет, 2006. - 60 с.
4. Северин С.Е., Соловьева Г.А. Практикум по биохимии. М.: Издательство МГУ, 1989. - 509 с.
5. Сиянова Н.С., Невзорова Т.А., Неуструева С.Н. Методическое руководство для практикума по биохимии: учебно-методическое руководство. Казань: КГУ, 2008. - 46 с.