ПОЛИГОНАЛЬНАЯ  ВИЗУАЛИЗАЦИЯ  МНОГОМЕРНЫХ  ДАННЫХ  И  РЕГРЕССИОННЫЙ  АНАЛИЗ  В  МЕТОДОЛОГИИ  ИССЛЕДОВАНИЙ  ХИРОНОМИД  НА  ПРИМЕРЕ  GLYPTOTENDIPES  GLAUCUS  MG

Шмаров  Вячеслав  Анатольевич

магистрант  2  года  обучения  направления  «Биология»  по  программе  «Экология»,  кафедра  биоэкологии  и  биоразнообразия  химико-биологического  института  БФУ  им.  И.  Канта,  г.  Калининград

E-mail:  enant@list.ru

Винокурова  Наталья  Владимировна

научный  руководитель,  канд.  биол.  наук,  доцент  кафедры  биоэкологии  и  биоразнообразия  БФУ  им.  И.  Канта,  г.  Калининград

Актуальность  темы

В  связи  с  увеличением  темпов  роста  хозяйственной  деятельности  человека  неминуемо  возрастают  и  масштабы  негативного  антропогенного  воздействия  на  окружающую  среду,  последствия  которых  стохастичны  и  поэтому  крайне  опасны.  В  настоящее  время  к  приоритетным  ксенобиотикам  относятся  тяжелые  металлы,  играющие  значительную  роль  и  в  загрязнении  водоемов.

Общеизвестно,  что  личинки  семейства  Chironomidae  являются  доминирующими  видами  макрозообентоса.  Хирономиды  имеют  самые  крупные  в  природе  политенные  хромосомы,  которые  позволяют  проводить  цитогенетический  анализ  воздействия  различных  токсических  веществ  на  хромосомные  перестройки,  вследствие  чего  хирономиды  представляют  собой  удобную  модель  при  анализе  антропогенных  воздействий.  Также  хирономиды  способны  легче,  чем  другие  водные  организмы,  накапливать  тяжелые  металлы  внутри  своего  тела  благодаря  высокой  проницаемости  покровов  [8].

Многие  исследователи  для  биомониторинга  водоёмов  предлагают  использовать  в  качестве  биоиндикаторов  личинок  хирономид  [1,  2,  5,  10,  12—16].  Большую  часть  аспектов  использования  хирономид  на  организменном,  популяционном,  экосистемном  уровне  биомониторинга  детально  рассматривает  Т.Д.  Зинченко  [7].  Однако  вопрос  о  воздействии  тяжелых  металлов  на  бентосные  организмы  и,  в  частности,  на  личинок  хирономид  на  сегодняшний  день  изучен  недостаточно.  Одним  из  препятствий  является  определение  специфичности  воздействия  отдельного  элемента  в  целом  комплексе  токсических  веществ,  встречающихся  в  водоёмах,  тем  более,  что  показатели  могут  разниться  в  зависимости  от  сезона  генерации  и  половой  принадлежности  особей  и  др.  [9].

На  сегодняшний  день  перед  экологической  наукой  стоит  задача  описания  принципов,  упрощений  и  абстракций,  к  которым  необходимо  научиться  сводить  многообразие  реального  мира  природы,  а  также  необходимость  построения  математических  моделей,  отражающих  сложную  систему  взаимосвязей  в  природе.  В  этом  случае  использование  инструментов  математического  аппарата,  методы  графического  представления  многомерных  данных  и  их  моделирования  можно  применять  в  качестве  специфических  методов  системной  экологии,  с  помощью  которых  исследуются  законы  функционирования  и  развития  экосистем  во  времени  и  пространстве  [6].

Цель  работы:  выявить  характер  зависимости  изменчивости  хромосомного  полиморфизма  природных  популяций  Glyptotendipes  glaucus  Mg.  нескольких  водоёмов  г.  Калининграда  от  сезона  генерации  и  половой  принадлежности,  а  также  экспериментальных  выборок  данного  вида  хирономид  от  содержания  тяжелых  металлов  в  экспериментальных  растворах.

Материалы  и  методы

Материалом  исследования  послужили  первичные  данные  цитогенетического  анализа  политенных  хромосом  личинок  хирономид  G.  glaucus  IV  стадии  развития,  собранных  из  6-ти  водоёмов  г.  Калининграда  (табл.  1),  а  также  —  личинок  хирономид  G.  glaucus  IV  стадии  развития,  выращенных  в  эксперименте  из  кладок,  собранных  в  прибрежной  зоне  тех  же  водоемов  с  погруженных  в  воду  частей  растений,  разлагающихся  макрофитов  и  коряг.  Даты,  места  сборов  и  количество  исследованных  особей  представлены  в  таблице  1.

Таблица  1.

Места  сбора  личинок  и  количество  исследованных  особей

Для  изучения  воздействия  металлов  на  политенные  хромосомы  G.  glaucus  в  лабораторных  условиях  были  выбраны  вещества  —  сульфат  цинка  (II),  сульфат  меди  (II),  сульфат  железа  (II),  в  концентрациях  равных  концентрациям  металлов  обнаруженных  в  грунтах  исследуемых  природных  водоемах  города  Калининграда  и  пересчитаны  на  молярную  концентрацию  металла.

Собранный  материал  погружали  на  месте  в  растворы  FeSO₄,  ZnSO₄  и  CuSO₄,  а  также  в  отстоянную  воду  (контроль)  (2—3  кладки  на  концентрацию).  После  выклева  (2—3-й  день)  личинок  перемещали  в  отстоянную  воду  (личинки  из  1  кладки  на  1,5  литра  воды).  Кормление  осуществлялось  1  раз  в  сутки  гидролизатом  дрожжей.  Личинки  выращивались  до  4-го  возраста  в  течение  2—4  месяцев,  после  чего  фиксировались  в  спиртоуксусной  смеси  [3,  4].

Математическая  обработка  и  визуализация  данных  проводилась  с  помощью  методов  профилограмм  и  регрессионного  анализа  с  использованием  пакета  программ  STATISTICA  5.0.

Всего  из  природных  популяций  Glyptotendipes  glaucus  было  исследовано  503  особи.  Из  экспериментального  материала  было  исследовано  60  особей  G.  glaucus  в  контроле,  и  380  особей  из  различных  концентраций  исследуемых  веществ.

Результаты  и  обсуждение

Число  исследованных  особей,  число  инверсионных  последовательностей  и  параметры  хромосомного  инверсионного  полиморфизма  личинок  хирономид  в  анализируемых  водоемах  представлены  в  табл.  2.

Таблица  2.

Общие  показатели  инверсионного  полиморфизма  исследованных  популяций  G.glaucus  города  Калининграда

Анализ  материала  по  особям  мужского  и  женского  пола  дает  следующие  результаты  (табл.3).

Таблица  3.

Основные  показатели  инверсионного  полиморфизма  самцов  и  самок  G.glaucus  из  природных  популяций  водоемов  г.  Калининграда

Популяция,  находясь  в  условиях  стресса,  начинает  формировать  большее  количество  геномных  комбинаций  из  имеющихся  последовательностей  дисков  хромосом,  а  увеличение  числа  инверсионных  последовательностей  не  так  велико,  что  и  приводит  к  закономерному  уменьшению  показателя  отношения  числа  инверсионных  последовательностей  к  числу  геномных  комбинаций  (ЧИП/ЧГК).

Интерпретация  данных  с  помощью  метода  профилограмм  позволяет  собрать  воедино  и  визуализировать  данные  о  влиянии  половой  дифференциации  (рис.  1)  и  сезона  генерации  (рис.  2)  особей  для  каждого  из  исследуемых  озер  на  одном  графике-полигоне.

Отношение  числа  инверсионных  последовательностей  к  числу  геномных  комбинаций  в  среднем  ниже  у  самок  Glyptotendipes  glaucus  по  сравнению  с  самцами  (1,02  и  1,42  соответственно),  что  может  быть  связано  с  более  высокими  генетическими  адаптационными  способностями  особей  женского  пола  (рис.  1).

Рисунок  1.  Профилограммы  значений  отношения  числа  инверсионных  последовательностей  к  числу  генотипических  комбинаций  (ЧИП/ЧГК)  для  особей  Glyptotendipes  glaucus  мужского  и  женского  пола  системы  водоемов  г.  Калининграда

Показатель  отношения  числа  инверсионных  последовательностей  к  числу  геномных  комбинаций  у  особей  летней  генерации  в  среднем  ниже,  чем  у  особей  зимней  (1,10  и  1,29  соответственно),  что  может  быть  связано  с  более  интенсивным  процессом  формирования  геномных  комбинаций  летом  в  виду  повышения  температуры  окружающей  среды  (рис.  2). 

Более  высокие  летние  показатели  температуры  интенсифицируют  биохимические  процессы  в  организме,  что,  в  свою  очередь,  приводит  к  известным  процессам  декомпактизации,  деконденсации  дисков  политенных  хромосом,  делая  их  более  доступными  для  мутагенных  лигандов  окружающей  природной  среды,  которые,  могут  индуцировать  хромосомные  перестройки.

Рисунок  2.  Профилограммы  значений  отношения  числа  инверсионных  последовательностей  к  числу  генотипических  комбинаций  (ЧИП/ЧГК)  для  зимней  и  летней  генераций  особей  Glyptotendipes  glaucus  системы  водоемов  г.  Калининграда

В  таблице  4  обобщены  и  приведены  основные  параметры  и  данные  эксперимента  по  определению  воздействия  ионов  тяжелых  металлов  на  показатели  инверсионного  полиморфизма  личинок  Glyptotendipes  glaucus,  графическая  интерпретация  эксперимента  отражена  на  рисунках  3—5.

Таблица  4. 

Параметры  хромосомного  инверсионного  полиморфизма  экспериментальных  личинок  Glyptotendipes  glaucus  в  различных  концентрациях  сульфатов  цинка,  меди,  железа

Рисунок  3.  Зависимость  отношения  числа  инверсионных  последовательностей  к  числу  геномных  сочетаний  в  экспериментальных  выборках  G.  Glaucus  от  концентраций  цинка  в  эксперименте

Рисунок  4.  Зависимость  отношения  числа  инверсионных  последовательностей  к  числу  геномных  сочетаний  в  экспериментальных  выборках  G.  glaucus  от  концентраций  меди  в  эксперименте

Как  видно  из  рисунков  3—5,  показатель  числа  инверсионных  последовательностей  в  концентрациях  железа  сохранялся  на  уровне  контроля  и  не  показал  значимости,  как  и  в  растворах  цинка  и  меди.  Однако  число  геномных  комбинаций,  сформированных  этими  последовательностями,  резко  возрастает  в  2—3  раза  вместе  с  увеличением  концентраций  железа  в  экспериментальном  растворе.

Рисунок  5.  Зависимость  отношения  числа  инверсионных  последовательностей  к  числу  геномных  сочетаний  в  экспериментальных  выборках  G.  glaucus  от  концентраций  железа  в  эксперименте

То  есть  этот  показатель  изменялся  в  соответствии  с  подобной  тенденцией  в  средах  с  цинком  и  медью.  Также  прослеживается  уменьшение  отношения  числа  инверсионных  последовательностей  к  числу  геномных  комбинаций  от  1,2  до  3,0  раз  вместе  с  возрастанием  концентраций  вещества.  Подобная  закономерность  так  же  наблюдалась  в  растворах  цинка  и  меди.

Видно,  что  параметр  оценки  хромосомного  полиморфизма  —  отношение  числа  инверсионных  последовательностей  к  числу  геномных  комбинаций  уменьшается  в  соответствие  с  увеличением  концентраций  тяжелых  металлов  в  экспериментальных  растворах.  Самое  высокое  значение  этого  показателя  (2,0)  наблюдалось  в  контрольных  выборках,  а  самые  низкие  показатели  —  в  высоких  концентрациях  исследуемых  металлов. 

Регрессионный  анализ  данных  зависимости  ЧИП/ЧГК  от  концентрации  металла  позволяет  получить  аналитическое  выражение  для  данной  функции,  а  также  оценить  скорость  уменьшения  ЧИП/ЧГК  под  действием  различных  металлов  и  сравнить  эти  показатели  в  ряду  металлов  Zn²⁺,  Сu²⁺,  Fе²⁺  .  (табл.  5,  рис.  6) 

Таблица  5. 

Параметры  регрессионного  анализа  данных  зависимости  ЧИП/ЧГК  от  концентрации  цинка,  меди  и  железа  в  эксперименте

Рисунок  6.  Графики  функции  ЧИП/ЧГК  =  f([Ме²⁺])  в  эксперименте  для  цинка,  меди  и  железа

Как  известно,  первая  производная  зависимой  величины  от  аргумента  есть  скорость  изменения  данной  величины  с  увеличением  аргумента.  Скорость  уменьшения  ЧИП/ЧГК  от  концентрации  металла  равна  производной  функции  ЧИП/ЧГК  от  [Ме²⁺],  взятой  с  противоположным  знаком.  Таким  образом,  скорость  уменьшения  ЧИП/ЧГК  с  увеличением  концентрации  ионов  металла  возрастает  в  ряду  Fе²⁺  →  Zn²⁺  →  Сu²⁺  (рис.  6),  что  означает  увеличение  степени  хромосомного  инверсионного  полиморфизма  в  этом  ряду  и  может  характеризовать  нарастание  потенциальной  мутагенной  активности  в  данном  ряду  металлов  в  отношении  политенных  хромосом  Glyptotendipes  glaucus  Mg.

Итак,  использование  метода  регрессионного  анализа  для  аналитической  интерпретации  воздействия  ряда  концентраций  сульфатов  меди,  цинка,  железа  на  хромосомный  инверсионный  полиморфизм  Glyptotendipes  glaucus  Mg.  в  эксперименте  позволяет  определить  градацию  потенциальной  мутагенной  активности  в  ряду  исследуемых  ионов  тяжелых  металлов.  Из  полученных  данных  заметно,  что  потенциальная  мутагенная  активность  металлов  возрастает  в  ряду  Fе²⁺  →  Zn²⁺  →  Сu²⁺,  причём  в  этом  ряду  наблюдается  закономерное  уменьшение  радиуса  иона  [11].  Можно  предположить,  что  в  живые  ткани  более  интенсивно  проникают  и  кумулируются  в  них  катионы  металлов  с  меньшим  радиусом,  вызывая  хромосомные  аберрации.

Заключение

Отношение  числа  инверсионных  последовательностей  к  числу  геномных  комбинаций  является  параметром  оценки  хромосомного  полиморфизма;  зависимость  этих  величин  друг  от  друга  носит  обратно  пропорциональный  характер.

Принадлежность  особи  к  женскому  полу,  летней  генерации,  а  также  возрастающая  концентрация  ионов  металлов  в  среде  (в  ряду  Fe,  Zn,  Cu)  вносят  вклад  в  уменьшение  отношения  числа  инверсионных  последовательностей  к  числу  геномных  комбинаций,  увеличивая  уровень  хромосомного  инверсионного  полиморфизма  Glyptotendipes  glaucus  Mg.

Визуализация  многомерных  данных  при  помощи  метода  профилограмм,  а  также  регрессионный  анализ  экспериментальных  выборок  составляют  предмет  интеграции  методов  системной  экологии  в  методологию  исследований  хирономид  и  в  случаях  ограниченного  количества  данных,  зачастую  недостаточных  для  умозрительного  заключения,  позволяют  анализировать  и  сравнивать  показатели  и  характеры  зависимостей,  выявляя  закономерности  процессов.

Список  литературы:

1.Балушкина  Е.В.  Структура  сообществ  донных  животных  и  оценка  экологического  состояния  р.  Ижоры:  влияние  гидрофизических  и  гидрохимических  параметров  воды  //  Биология  внутренних  вод.  2003.  №  1.  С.  74—80.

2.Балушкина  Е.В.  Функциональное  значение  личинок  хирономид  в  континентальных  водоемах.  Л.:  Наука,  1987.  179  с. 

3.Винокурова  Н.В.,  Данилова  М.В.,  Сидорова  В.В.  //  Влияние  оксида  ванадия  на  конъюгацию  гомологов  политенных  хромосом  кариотипа  клеток  слюнных  желёз  Chironomus  plumosus  //  Материалы  международной  научно-технической  конференции  «Наука  и  образование».  —  2004.  —  ч.  6.  —  167  —  170  с.

4.Винокурова  Н.В.,  Данилова  М.В.,  Шартон  А.Ю.  К  методике  выращивания  хирономид  в  лабораторных  условиях  и  их  использование  в  токсикологических  экспериментах//Теоретические  и  прикладные  аспекты  экологии  и  биологии:  Межвуз.  сб.  ст./Калининград:  Изд-во  РГУ  им.  И.  Канта,2008.  —  с.  77—79.

5.Винокурова  Н.В.,  Червоткина  Т.А.  Новые  данные  по  фауне  хирономид  (Diptera:  Chironomidae)  водоёмов  Калининградской  области  //  Вестник  Балтийского  федерального  университета  им.  И.  Канта.  2011.  Вып.  7.  С.  103—112.

6.Дулепов  В.И.,  Лескова  О.А.,  Майоров  И.С.  Системная  экология.  —  Владивосток:  ВГУЭС,  2004.  —  252  с. 

7.Зинченко  Т.Д.  Биоиндикация  как  поиск  информативных  компонентов  водных  экосистем  (на  примере  хирономид  —  Diptera,  Chironomidae)  //  Чтения  памяти  Владимира  Яковлевича  Леванидова.  2005  Вып.  3  ,  С.  338  —  359.

8.Кикнадзе  И.А.,  Шилова  А.И.,  Керкес  И.Е.  и  др.  Кариотипы  и  морфология  личинок  трибы  Chironomini.  Атлас.  Новосибирск:  Наука,  1991.  —  115  с.

9.Майстренко  В.Н.,  Хамитов  Р.З.,  Будников  Г.К.  Эколого-аналитический  мониторинг  суперэкотоксикантов.  —  М.:  Химия,  1996.  —  319  с.

10.Сергеева  И.В.,  Аникина  М.А.  Личинки  хирономид  Procladius  (Diptera,  Chironomidae)  как  биоиндикаторы  загрязнения  реки  Волги  у  Саратова  и  её  притоков  с  большой  антропогенной  нагрузкой  //  Вестник  Саратовского  госагроуниверситета  им.  Н.И.  Вавилова.  2009.  №  4.  С.  26—28.

11.Рабинович  В.А.,  Хавин  З.Я.  Краткий  химический  справочник,  3-е  изд.,  перераб.  и  доп.  —  Л.:  Химия,  1991.  —  432  с.

12.Hirvenoja  M.,  Michailova  P.  Chironomus  melanotus  Keyl  and  its  taxonomical  and  ecological  relations  to  C.  riihimakiensis  Wülker  (Diptera,  Chironomidae)  //  Spixiana.  1991.  V.  14  (3)  P.  309—320.

13.Johnson  R.K.,  Wiederholm  T.,  Rosenberg  D.M.  Freshwater  biomonitoring  using  individual  organisms,  populations  and  species  assemblages  of  benthic  macro-invertebrates  //  Freshwater  biomonitoring  and  benthic  macroinvertebrates  /  eds  Rosenberg  D.M.,  Resh  V.H.  N.Y.:  Chapman  and  Hall,  1993.  P.  40—158.

14.Thorat  L.,  Bimalendu  N.  Trends  in  Chironomid  Research  //Chironomus  Newsletter  on  Chironomidae  Research.  2010.  №  23.  P.  34—35. 

15.Warwick  W.F.  Morphological  deformities  in  larvae  of  Procladius  Scuse  (Diptera:  Chironomidae)  and  their  biomonitoring  potential  //  Can.  J.  Fish.  Aquat.  Sci.  1989.  V.  46.  P.  1255—1271.

16.Wiederholm  T.  Chironomids  as  indicators  of  water  quality  in  Swedish  lakes//  Naturvardsverkets  Limnologistika  Undersokningar.  1976.  V.  10.  P.  1—17.