ПЕРСПЕКТИВЫ  РАЗРАБОТКИ  И  СОЗДАНИЯ  ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ  ТЕСТ-СИСТЕМЫ  ДЛЯ  ДИАГНОСТИКИ  ХЕЛИКОБАКТЕРИОЗА

Мокрецова  Ирина  Михайловна

магистрант,  кафедра  микробиологии  ВятГУ,  г.  Киров

E-mail: 

Богачева  Наталья  Викторовна

научный  руководитель,  канд.  мед.  наук,  доцент  ВятГУ,  г.  Киров

Сегодня  Helicobacter  pylori  во  всем  мире  считается  одним  из  самых  важных  и  распространенных  патогенных  микроорганизмов.  Так,  в  развитых  странах  H.  pylori  обнаруживается  у  10  %  лиц  в  возрасте  до  20  лет,  а  к  60  годам  инфицированность  достигает  50  %.  В  России  и  в  развивающихся  странах  к  10  годам  жизни  инфицированными  оказываются  45—55  %  детей,  у  людей  старше  20  лет  инфицированность  приближается  к  98  %.  Помимо  хронического  гастрита,  H.  pylori  является  этиологическим  агентом  пептической  язвы  желудка,  а  также  подслизистой  лимфомы  и  аденокарциномы  желудка  [5]. 

Все  способы  диагностики  Н.  pylori,  используемые  в  настоящее  время,  условно  можно  разделить  на  прямые  и  непрямые  (косвенные),  на  инвазивные  и  неинвазивные.  Инвазивные  методы  требуют  проведения  биопсии  слизистой  оболочки  желудка  при  эндоскопическом  обследовании,  неинвазивные  —  не  требуют  биопсии.  Прямые  методы  позволяют  непосредственно  выявить  H.  pylori,  косвенные  методы  регистрируют  не  саму  бактерию,  а  последствия  ее  персистирования  в  организме  [2].

К  инвазивным  относятся  бактериологический  метод,  гистологическое  исследование,  ПЦР  слизистой  оболочки  желудка,  цитологический  метод,  уреазные  тесты  биоптатов.  К  неинвазивным  —  серологические  методы,  определение  специфических  антител  к  H.  pylori  в  кале,  слюне,  моче,  ПЦР  слюны,  кала,  зубного  налета,  уреазные  дыхательные  тесты  [1,  5]. 

Выбор  метода  диагностики  зависит  от  условий,  в  которых  проводится  исследование:  необходимо  учитывать  возможность  проведения  эндоскопии  и  биопсии,  оснащенность  лаборатории,  наличие  необходимой  техники  и  инструментов,  подготовку  медицинского  персонала  [5]. 

Самым  специфичным  методом  лабораторной  диагностики  H.  рylori  является  бактериологический.  Для  посева  используют  биопсийный  материал,  высеваемый  на  особые  питательные  среды,  инкубация  посевов  осуществляется  при  микроаэрофильных  условиях  в  течение  5—7  суток.  Длительность  и  трудоемкость  не  дают  возможности  широко  использовать  этот  метод,  но  только  он  позволяет  точно  идентифицировать  возбудителя  и  исследовать  его  чувствительность  к  антимикробным  препаратам. 

Уреазные  тесты  базируются  на  том,  что  никакие  другие  бактерии,  кроме  H.  pylori,  не  способны  продуцировать  уреазу  в  условиях  желудка  в  таких  количествах,  что  уреазная  активность  проявляется  не  только  в  чистой  культуре,  но  и  в  биоптатах  слизистой  оболочки  желудка.  Предложены  различные  варианты  тестов:  тест  со  средой  Христенсена,  четырехчасовой  быстрый  уреазный  тест,  одноминутный  тест,  «CLO-тест»,  «Campy-test»,  «Биохит»  и  др.  Почти  все  уреазные  тесты  обладают  высокой  чувствительностью  и  специфичностью,  к  их  преимуществам  относятся  простота  выполнения,  низкая  стоимость  и  быстрота  получения  результатов.  В  то  же  время  у  лиц  с  низкой  обсемененностью  слизистой  оболочки  желудка  H.  pylori  могут  отмечаться  ложноотрицательные  результаты  тестов,  а  ложноположительный  результат  обусловливается  деятельностью  других  уреазопродуцирующих  бактерий  (псевдомонады,  стрептококки)  [5]. 

Неинвазивная  дыхательная  диагностика  основана  на  том,  что  в  желудке  под  действием  уреазы  принятая  пациентом  мочевина,  меченная  изотопом  углерода  ¹³С  или  ¹⁴С,  расщепляется  до  аммиака  и  углекислого  газа,  содержащего  метку.  Для  регистрации  радиоактивного  ¹⁴С  необходим  сцинтилляционный  счетчик,  для  определения  ¹³C  используют  масс-спектрометры.  Оба  варианта  являются  высокоспецифичными  и  высокочувствительными,  однако  широкому  внедрению  метода  мешают  значительная  стоимость,  трудоемкость,  необходимость  наличия  специального  оборудования  и  высококвалифицированного  персонала,  а  радиационное  воздействие  недопустимо  при  диагностических  процедурах  у  беременных  и  детей.

«Хелик-тест»  основан  на  оценке  концентрации  аммиака  в  выдыхаемом  воздухе  после  приема  порции  мочевины  с  обычным  изотопным  составом.  При  наличии  H.  pylori  ее  уреаза,  гидролизуя  принятую  мочевину,  вызывает  усиленное  образование  аммиака  и  приводит  к  нарастанию  его  концентрации  в  выдыхаемом  воздухе.  Измерение  концентрации  аммиака  проводится  с  помощью  индикаторных  трубок.  Метод  применим  в  педиатрии,  имеет  невысокую  стоимость,  прост  в  исполнении,  однако  количество  сомнительных  результатов  превышает  10  %.

Метод  ПЦР  основан  на  идентификации  видоспецифичного  для  H.  pylori  фрагмента  ДНК.  Это  один  из  наиболее  точных  и  высокоспецифичных  методов.  Материалом  для  ПЦР  может  служить  не  только  биоптат  слизистой  оболочки  желудка,  но  и  желудочный  сок,  слюна,  зубной  налет,  смывы  из  ротовой  полости  и  кал.  Из-за  сложности  и  высокой  стоимости  в  рутинной  медицинской  практике  метод  не  нашел  широкого  применения.

Иммунологические  методы  широко  используют  для  проведения  эпидемиологических  исследований,  для  скрининга  больных  с  диспепсическими  жалобами,  так  как  уже  в  первые  недели  инфицирование  H.  pylori  сопровождается  общим  местным  иммунным  ответом  организма  с  накоплением  специфических  антител.  Наибольшее  распространение  в  мире  получил  метод  твердофазного  иммуноферментного  анализа  (ИФА)  [5].  Чувствительность  этого  метода  в  среднем  составляет  90—95  %,  специфичность  —  80—90  %  [3].

Однако  метод  имеет  и  ряд  недостатков:  длительная  серопозитивность  сохраняется  после  успешной  эрадикации  (ложноположительные  тесты),  что  исключает  возможность  использования  метода  для  контроля  лечения;  до  60-го  дня  с  момента  инфицирования  из-за  слабости  иммунного  ответа  могут  быть  ложноотрицательные  тесты  [5].

Иммунохроматографические  методы  основаны  на  диффузном  движении  элюента  (раствора  анализируемого  вещества)  вдоль  мембраны  или  мультимембранного  композита,  которое  приводит  к  образованию  на  разных  ее  участках  специфических  иммунных  комплексов.  Принцип  большинства  уже  разработанных  тест-систем  основан  на  неконкурентном  (сэндвич)  методе,  при  котором  антиген  образует  комплекс  с  двумя  молекулами  антител  —  на  поверхности  конъюгата  с  маркером  и  иммобилизованными  в  аналитической  зоне  [4].

Среди  иммунохроматографических  тест-систем  в  настоящее  время  на  российском  рынке  представлены  следующие:  ImmunoCard  STAT  HpSA  (Meridian  Bioscience,  Inc.,  США),  SD  BIOLINE  H.  pylori  Ag  (Standard  Diagnostics,  Inc.,  Республика  Корея),  CITO  TEST  H.  pylori  Ag  (CerTest  Biotec  S.L.,  Испания),  Хелико  Стик  (Novamed,  Израиль). 

Из  недостатков  разработанных  ИХА  тест-систем  можно  назвать  то,  что  они  предназначены  для  качественного  определения  антигена  H.  pylori  (уреазы)  и  не  определяют  его  количественное  содержание.  В  качестве  диагностического  материала  в  них  может  быть  использован  только  один  вид  биологического  материала  –  кал,  к  которому  предъявляются  определенные  требования  по  органолептическим  свойствам,  сбору,  хранению  и  транспортировке. 

Исходя  из  этого,  одним  из  вариантов  совершенствования  диагностических  тест-систем  является  отработка  методики  использования  в  качестве  биологического  материала  для  иммунохроматографического  анализа  содержимого  зубодесневых  карманов,  в  которых  персистенция  H.  pylori  является  научно  доказанным  фактом  [8]. 

Также  актуальной  является  разработка  иммунохроматографических  тест-систем,  позволяющих  рационально  подобрать  алгоритм  эрадикационной  терапии.  Серопозитивность  к  H.  pylori  среди  лиц  с  патологией  желудка  и  двенадцатиперстной  кишки  достигает  около  80  %  [7],  однако  не  все  штаммы  H.  pylori  обладают  патогенностью.  К  патогенным,  способным  вызывать  хронизацию  процесса,  влиять  на  тяжесть  течения  заболевания  и  его  прогрессирование,  относятся  штаммы  микроорганизма,  имеющие  гены  cagA,  iceA,  babA  [6].  В  связи  с  этим  перспективным  направлением  является  разработка  иммунохроматографических  тест-систем  с  использованием  моноклональных  антител  к  генам  патогенности.  Применение  подобных  тест-систем  позволит  рационально  назначать  эрадикационную  терапию  и  исключить  риск  развития  дисбактериоза  в  результате  применения  многокомпонентной  антибактериальной  схемы  лечения  хеликобактериоза. 

Таким  образом,  перспективы  разработки  и  создания  иммунохроматографической  тест-системы  для  диагностики  хеликобактериоза  должны  быть  направлены  на  обеспечение  быстроты,  нетрудоемкости,  высокоспецифичности  и  чувствительности  анализа,  с  возможностью  количественного  определения  антигена  H.  pylori  в  различном  биологическом  материале  и  обоснованного  отбора  лиц  для  назначения  лечения  по  эрадикации  микроорганизма.

Список  литературы:

1.Барышникова  Н.В.  Актуальные  проблемы  диагностики  хеликобактериоза  //  Экспериментальная  и  клиническая  гастроэнтерология.  —  2009.  —  №  2.  —  С.  50.

2.Диагностика  и  лечение  заболеваний  желудочно-кишечного  тракта,  ассоциированных  с  инфекцией  Helicobacter  pylori.  Практическое  руководство  для  врачей.  М.,  2006.  [Электронный  ресурс]  —  Режим  доступ.  —  URL:  http://www.biograd.ru/publications/practical_guides_for  _doctors/helicobacter/contents  (дата  обращения  1.11.2013  г.)

3.Корниенко  Е.А.  Неинвазивные  методы  диагностики  инфекции,  вызванной  Helicobacter  pylori  /  Е.А.  Корниенко,  В.Е.  Милейко,  В.А.  Самокиш,  О.Н.  Нажиганов  //  Педиатрия.  —  1999.  —  №  1.  —  С.  37—41.

4.Метод  калибровочных  кривых  для  иммунохроматографических  экспресс-тестов.  Часть  1.  Иммунохроматографические  экспресс-тесты  с  коллоидным  золотом  /  С.С.  Голубев,  Б.Б.  Дзантиев,  А.В.  Жердев,  Ю.В.  Киселева,  Я.А.  Короленко,  Ю.А.  Кудеяров,  В.М.  Малюченко,  Н.И.  Смирнова,  Д.В.  Сотников.  ВНИИМС,  01.10.2012.  —  18  с. 

5.Методы  диагностики  хеликобактериоза  /  Под  ред.  А.В.  Козлова,  В.П.  Новиковой.  СПб.:  Издательство  «Диалект»,  2008.  —  88  с.

6.Особенности  полиморфизма  генов  вирулентности  Helicobacter  pylori  и  генов  ИЛ-1  при  язвенной  болезни  желудка  и  двенадцатиперстной  кишки,  ассоциированной  с  Helicobacter  pylori  /  О.А.  Чернова,  Э.Р.  Насыбуллина,  О.В.  Горшков,  Г.Ф.  Шаймарданова,  В.М.  Чернов,  Р.А.  Абдулхаков  //  Бюллетень  сибирской  медицины,  2005.  Приложение  2.  —  С.  31—35. 

7.Сварваль  А.В.  Характеристика  популяции  возбудителя  и  изучение  цитокинового  звена  иммунитета  у  лиц,  инфицированных  Helicobacter  pylori.  Автореферат  диссертации  на  соискание  ученой  степени  кандидата  медицинских  наук.  СПб.,  2012.  —  26  с.

8.Угольник  Т.С.  Антитела  к  CagA  антигену  Helicobacter  pylori  в  сыворотке  в  группах  носителей  HP  в  ротовой  полости  //  Международный  Евро-Азиатский  конгресс  по  инфекционным  болезням.  Т.1.  Актуальные  вопросы  инфекционной  патологии.  Витебск,  5—6  июня  2008.  —  С.  115.