ВЛИЯНИЕ  МЕТИЛГЛИОКСАЛЯ  НА  ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ  МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ  СТВОЛОВЫХ  КЛЕТОК  ЖИРОВОЙ  ТКАНИ  IN   VITRO

Мосунов  Иван  Николаевич

студент  6  курса,  Медико-биологический  факультет  СибГМУ,  РФ,  г.  Томск

E-mail: 

Розенбаум  Юлия  Викторовна

студент  5  курса,  Медико-биологический  факультет  СибГМУ,  РФ,  г.  Томск

E-mail: 

Агаб  Алена  Владимировна

студент  5  курса,  Медико-биологический  факультет  СибГМУ,  РФ,  г.  Томск

E -mail: 

" target="_blank">

Иванов  Владимир  Владимирович

научный  руководитель,  канд.  биол.  наук,  с.н.с.  ЦНИЛ  СибГМУ,  РФ,  г.  Томск

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность

Сахарный  диабет  —  нарушение  обмена  веществ,  проявляющееся  высокими  уровнями  глюкозы  в  крови,  который  может  быть  разделен  на  две  главные  группы  [5,  с.  8].  К  первой  группе  (тип  1)  относят  развитие  диабета,  вызванное  аутоиммунной  реакцией,  вследствие  которой  происходит  разрушение  β-клеток  поджелудочной  железы  [13,  с.  8].  Вторая  группа  —  инсулиннезависимый  сахарный  диабет  (тип  2,  T2DM),  проявляющийся  резистентностью  к  действию  инсулина  [7,  с.  8].  Сахарный  диабет  приводит  ко  многим  осложнениям,  в  том  числе  и  к  ожирению.  В  свою  очередь  ожирение  является  предрасполагающим  фактором  развития  ряда  заболеваний  [1,  с.  7;  8,  11,  14,  15,  с.  8;  21,  с.  9].

Ожирение  может  развиваться  несколькими  путями:  по  типу  гипертрофии  (накопление  в  адипоцитах  липидов)  и  гиперплазии  (увеличение  количества  адипоцитов  из  клеток-предшественниц  —  мезенхимальных  стволовых  клеток  (adMSC))  [4,  с.  7].  В  жировой  ткани  находится  большое  количество  клеток-предшественниц,  которые  могут  дифференцироваться  в  адипогенном,  хондрогенном,  миогенном  и  остеогенном  направлении  [12,  с.  8].

При  сахарном  диабете  и  гиперлипидемии  в  крови  повышается  содержание  свободных  жирных  кислот  и  метилглиоксаля  (MG)  [9,  с.  8].  MG  является  высокоактивным  метаболитом  организма,  образующийся  в  физиологических  условиях  как  побочный  продукт  обмена  глюкозы,  перекисного  окисления  липидов,  при  метаболизме  ацетона  и  ацетоацентона  [20,  с.  9].  В  нормальных  условиях  он  утилизируется  посредством  глиоксалазной,  альдолазной  систем  и  альдегиддегидрогеназой  до  пирувата,  D-лактата  или  ацетола  [16,  с.  8].  MG  является  одной  из  причин  образования  конечных  продуктов  гликирования,  которые  приводят  к  ряду  заболеваний  [3,  с.  7;  10,  16,  с.  8;  18,  22,  с.  9].

В  виду  этого  можно  предположить,  что  при  сахарном  диабете  2  типа  при  повышении  уровня  глюкозы  в  крови  происходит  увеличение  содержания  MG,  что  может  стимулировать  дифференцировку  adMSC  в  адипоциты,  что  является  одной  из  причин  развития  ожирения.

Зная  механизм  развития  ожирения,  можно  прекратить/снизить  дифференцировку  adMSC  в  адипоциты,  что  приведет  к  снижению  ожирения  (в  комплексе  с  препаратами,  действующими  на  другие  пути  его  развития),  являющимся  одним  из  факторов  риска  развития  серьезных  осложнений  сахарного  диабета,  а  значит  и  улучшению  качества  жизни.

Цель  исследования:

Исследовать  влияние  разных  концентраций  метилглиоксаля  на  дифференцировку  мезенхимальных  стволовых  клеток  жировой  ткани  в  адипоциты.

Задачи:

1.  выделить  adMSC  из  эпидедимальной  жировой  ткани  крыс;

2.  нарастить  массу  клеток  adMSC;

3.  исследовать  влияние  известных  адипогенов  (инсулин,  дексаметазон,  IBMX)  на  процесс  дифференцировки  изолированных  adMSC;

4.  изучить  влияние  различных  концентраций  метилглиоксаля  на  дифференцировку  культуры  adMSC  в  адипоциты.

МАТЕРИАЛ  И  МЕТОДЫ  ИССЛЕДОВАНИЯ

1.  Материал  исследования

1.1. Характеристика  исследуемого  материала

Эксперимент  проводился  на  линии  мезенхимальных  стволовых  клеток,  выделенных  из  эпидедимальной  жировой  ткани  (adMSC)  крыс  самцов  линии  Wistar.  После  выделения  клетки  были  рассеяны  на  культуральные  планшеты  и  культивировались  до  объема,  пригодного  к  проведению  эксперимента. 

1.2. Получение  мезенхимальных  стволовых  клеток  из  эпидедимальной  жировой  ткани  крысы

Для  получения  adMSC  крысу  умерщвляли  при  помощи  CO₂-асфиксии.  Клетки  выделяли  в  соответствии  с  протоколом,  предложенным  Shaini  Jain  и  Hariom  Yadav  (2007)  [6,  с.  8].

1.3.Стимуляция  адипогенеза  adMSC

24-луночный  планшет  был  разделен  на  6  групп  исследования  по  4  лунки  для  каждой  группы  в  5  культуральных  планшетах.  Группа  «контроль  –  »  культивировалась  без  добавления  стимуляторов  адипогенеза.  В  группу  «контроль  +  »  в  качестве  стимуляторов  были  добавлены  инсулин,  дексаметазон  и  IBMX.  Остальные  4  группы  культивировались  с  разными  концентрациями  MG  (250,  500,  750  и  1500  мкM  соответственно).  В  каждую  лунку  вносили  1  мл  культуральной  среды,  соответствующей  группе  исследования.

1.4.Подсчет  клеток

Для  определения  количества  полученных  клеток  проводили  их  подсчет  в  камере  Горяева. 

2.  Методы  исследования

2.1.Оценка  изменения  морфологии  клеток

Анализ  результатов  исследования  проводили  методом  микроскопии  каждый  день  в  течение  всего  времени  эксперимента.  Для  этого  в  каждой  лунке  исследовали  2-3  поля  зрения.  Оценивали  морфологические  изменения  клеток  по  сравнению  с  «нулевым»  днем  эксперимента  и  с  группами  контроля  («контроль  –  »  и  «контроль  +  »).

РЕЗУЛЬТАТЫ  ИССЛЕДОВАНИЯ

В  результате  эксперимента  было  установлено,  что  через  сутки  после  посева  выращенных  adMSC  в  24-луночные  планшеты  клетки  образуют  субконфлюентный  монослой  и  имеют  одинаковую  морфологическую  структуру  (рис.  1).

Рисунок  1.  Микрофотографии  монослоя  adMSC   до  начала  стимуляции  адипогенеза  (ув.  250  х)

Рисунок  2.  Микрофотография  монослоя  adMSC   через  7  суток  после  стимуляции  адипогенеза  (ув.  250  х)

Через  7  суток  после  начала  эксперимента  (рис.  2)  становится  видно,  что  самым  сильным  адипогенным  эффектом  обладают  известный  адипогенный  «коктейль»,  содержащий  инсулин,  дексаметазон  и  IBMX.  Схожий  с  ним  эффект  оказывает  MG  в  дозе  750  мкM.  В  то  же  время  для  трансформированных  клеток,  инкубированных  с  MG  в  дозе  500  и  750  мкM,  характерно  отлипание  от  пластика,  в  то  время  как  при  стимуляции  адипогенеза  инсулином,  дексаметазоном  и  IBMX  наблюдается  в  основном  диффузное  накопление  капель  жира  в  клетках  с  сохранением  способности  к  адгезии.  Доза  1500  мкM  MG  оказалась  токсичной  для  мезенхимальных  стволовых  клеток,  выделенных  из  эпидедимальной  жировой  ткани  крыс.  При  отсутствии  стимуляции  адипогенеза  никаких  изменений  в  структуре  монослоя  на  протяжении  всего  эксперимента  не  наблюдалось,  что  свидетельствует  об  устойчивости  изолированных  из  жировой  ткани  крыс  adMSC  к  спонтанной  дифференцировке.

ОБСУЖДЕНИЕ  РЕЗУЛЬТАТОВ

Одним  из  осложнений  T2DM  является  ожирение  [1,  с.  7;  8,  15,  с.  8].  Это  может  быть  связано  с  нарушением  метаболизма  свободных  жирных  кислот,  концентрация  которых  резко  возрастает  при  СД  [1,  с.  7].  При  их  метаболизме  в  клетках  увеличивается  содержание  метилглиоксаля.  Глиоксалазная  система  при  таком  уровне  MG  не  будет  успевать  превращать  его  в  лактат,  в  результате  чего  он  будет  накапливаться  в  организме  [17,  с.  8].

По  результатам  нашего  исследования  можно  сделать  вывод,  что  MG  может  стимулировать  дифференцировку  adMSC  крыс  в  адипоциты.  Этот  эффект  сравним  со  стимуляцией  при  помощи  известных  адипогенов  (инсулин,  дексаметазон  и  IBMX).  Наиболее  высоким  адипогенным  эффектом  обладает  MG  в  концентрации  750  мкM,  что,  по  данным  некоторых  исследователей,  совпадает  с  уровнем  MG,  находящегося  в  крови  пациентов  с  T2DM,  страдающих  ожирением.

Механизм  адипогенного  эффекта  MG  не  известен.  В  то  же  время  показано,  что  трасформация  мезенхимальных  стволовых  клеток  в  адипоциты  под  действием  инсулина,  дексаметазона  и  IBMX  осуществляется  за  счет  увеличения  внутриклеточного  содержания  цАМФ  [19,  с.  9].  Возможно,  MG  также  способствует  данному  процессу  через  гликирование  регуляторных  белков  [3,  с.  7;  10,  16,  с.  8;  22,  с.  9],  ферментов  [2,  с.  7],  что  модулирует  их  функциональную  активность.

Обнаруженная  нами  способность  MG  вызывать  адипогенез  подтверждается  тем,  что  повышение  уровня  глутатиона  в  клетках,  являющегося  важным  компонентом  в  детоксикации  MG  глиоксалазной  системой,  препятствует  адипогенезу.

ВЫВОДЫ

1.  Использование  протокола,  предложенного  Shaini  Jain  и  Hariom  Yadav  (2007)  [22],  позволяет  получить  высокий  выход  мезенхимальных  стволовых  клеток  из  эпидедимальной  жировой  ткани  крысы.

2.  Стандартные  адипогены  (1  μM  инсулин,  0,5  мM  дексаметазон,  10  мг/мл  IBMX)  способствовали  дифференцировке  мезенхимальных  стволовых  клеток  в  адипоциты.

3.  Метилглиоксаль  в  концентрациях  250—750  μM  стимулирует  дифференцировку  мезенхимальных  стволовых  клеток  по  адипогенному  пути.

4.  С  увеличением  концентрации  метилглиоксаля  в  культуральной  среде  увеличивается  выраженность  адипогенеза.

5.  Высокая  концентрация  метилглиоксаля  (1500  μM)  оказывает  цитотоксический  эффект  на  мезенхимальные  стволовые  клетки.

Список  литературы:

1.Балаболкин  М.И.,  Чернышева  Т.Е.  Функциональное  состояние  симпатико-адреналовой  системы  на  этапах  формирования  поздних  осложнений  сахарного  диабета  //  Терапевтический  архив.  —  2003.  —  Т.  75.  —  №  10.  —  С.  11—16.

2.Ahmed  N.  Peptide  mapping  identifies  hotspot  site  of  modification  in  human  serum  albumin  by  methylglyoxal  involved  in  ligand  binding  and  esterase  activity  //  J  Biol  Chem.  —  2005.  —  №  280.  —  P.  5724—5732.

3.Cantero  A.V.  Methylglyoxal  induces  advanced  glycation  end  product  (AGEs)  formation  and  dysfunction  of  PDGF  receptor-beta:  implications  for  diabetic  atherosclerosis  //  FASEB  J.  —  2007.  —  №  21.  —  P.  3096—3106.

4.de  Ferranti  S.  The  perfect  storm:  obesity,  adipocyte  dysfunction,  and  metabolic  consequences  //  Clinical  Chemistry.  —  2008.  —  №  54.  —  P.  945—955.

5.Giacco  F.  Oxidative  stress  and  diabetic  complications  //  Circ.  Res.  —  2010.  —  V.  107.  —  №  9.  —  P.  1058—1070.

6.Jain  S.,  Yadav  H.  Preparation  of  Isolated  Adipocytes/Pre-adipocytes  from  Rats  //  Protocol  from  the  University  of  Lund,  Version  860415.  [Электронный  ресурс]  —  Режим  доступа.  —  URL:  http://www.whitelabs.org/Lab_Protocols/Mammalian_Cell_culture_and_manipulations/adipocyte_isolation-Pat's_protocols.htm  (дата  обращения  5.11.2013).

7.Kahn  S.E.  The  relative  contributions  of  insulin  resistance  and  beta-cell  dysfunction  to  the  pathophysiology  of  Type  2  diabetes  //  Diabetologia.  —  2003.  —  V.  46.  —  №  1.  —  P.  3—19.

8.Kourembanas  S.  Hypoxia  induces  endothelin  gene  expression  and  secretion  in  cultured  human  endothelium  //  Clin.  Invest.  —  1991.  —  №  88.  —  P.  1054—1057.

9.Lapolla  A.  Glyoxal  and  methylglyoxal  levels  in  diabetic  patients:  quantitative  determination  by  a  new  GC/MS  method  //  Clin  Chem  Lab  Med.  —  2003.  —  №  41.  —  P.  1166—1173.

10.Oya  T.  Methylglyoxal  modification  of  protein.  Chemical  and  immunochemical  characterization  of  methylglyoxal-arginine  adducts  //  J  Biol  Chem.  —  1999.  —  №  274.  —  P.  18492—18502.

11.Pugliese  G.  Chronic  kidney  disease  in  type  2  diabetes:  Lessons  from  the  Renal  Insufficiency  And  Cardiovascular  Events  (RIACE)  Italian  Multicentre  Study  //  Nutr  Metab  Cardiovasc  Dis.  —  2014.  —  V.  24.  —  №  8.  —  P.  815—822.

12.Rahaman  M.N.  Stem  cell-based  composite  tissue  constructs  for  regenerative  medicine  //  Biotechnol  Bioeng.  —  2005.  —  №  91.  —  P.  261—284.

13.Rains  J.L.  Oxidative  stress,  insulin  signaling,  and  diabetes  //  Free  Radic.  Biol.  Med.  —  2011.  —  V.  50.  —  №  5.  —  P.  567—575.

14.Scanlon  P.H.  Epidemiological  Issues  in  Diabetic  Retinopathy  //  Middle  East  Afr  J  Ophthalmol.  —  2013.  —  V.  20.  —  №  4.  —  P.  293—300.

15.Shen  G.X.  Oxidative  stress  and  diabetic  cardiovascular  disorders:  roles  of  mitochondria  and  NADPH  oxidase  //  Can,  J.  Physiol.  Pharmacol.  —  2010.  —  V.  88.  —  №  3.  —  P.  241—248.

16.Thornalley  P.J.  Dicarbonyl  intermediates  in  the  Maillard  reaction  //  Ann  N.Y  AcadSci.  —  2005.  —  №  1043.  —  P.  111—117.

17.Thornalley  PJ.  Pharmacology  of  methylglyoxal:  formation,  modification  of  proteins  and  nucleic  acids,  and  enzymatic  detoxification  —  a  role  in  pathogenesis  and  antiproliferative  chemotherapy  //  General  Pharmac.  —  1996.  —  №  27.  —  P.  565—573.

18.Thornalley  P.J.  Quantitative  screening  of  advanced  glycationendproducts  in  cellular  and  extracellular  proteins  by  tandem  mass  spectrometry  //  Biochem  J.  —  2003.  —  №  375.  —  P.  581—592.

19.Tung  E.W.  Induction  of  adipocyte  differentiation  by  polybrominated  diphenyl  ethers  (PBDEs)  in  3T3-L1  cells  //  PLoS  One.  2014.  №  4.  —  e94583.  [Электронный  ресурс]  —  Режим  доступа.  —  URL:  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3983240/  (дата  обращения  16.05.2014).

20.Wu  L.  Is  methylglyoxal  a  causative  factor  for  hypertension  development?  //  Can  J  PhysiolPharmacol.  —  2006.  —  №  84.  —  P.  129—139.

21.Yarandi  S.S.  Diabetic  gastrointestinal  motility  disorders  and  the  role  of  enteric  nervous  system:  Current  status  and  future  directions  //  Neurogastroenterol  Motil.  —  2014.  —  V.  26.  —  №  5.  —  P.  611—624.

22.Yim  H.S.  Free  radicals  generated  during  the  glycation  reaction  of  amino  acids  by  methylglyoxal.  A  model  study  of  protein-cross-linked  free  radicals  //  J  Biol  Chem.  —  1995.  —  №  270.  —  P.  28228—28233.