ОСОБЕННОСТИ  ИЗМЕНЕНИЯ  АНТИОКСИДАНТНОГО  ПОТЕНЦИАЛА  СУСПЕНЗИОННОЙ  КУЛЬТУРЫ  ПАЖИТНИКА  ГРЕЧЕСКОГО  В  ХОДЕ  РОСТОВОГО  ЦИКЛА

Драгун  Полина  Алексеевна

студент  5  курса,  кафедра  клеточной  биологии  и  биоинженерии  растений  БГУ,  Республика  Беларусь,  г.  Минск

E-mail:   polla.emeliyanova@gmail.com

Логвина  Анна  Олеговна

научный  руководитель,  ассистент  кафедры  клеточной  биологии  и  биоинженерии  растений  БГУ,  Республика  Беларусь,  г.  Минск

В  настоящее  время  актуальными  для  изучения  становятся  растения,  являющиеся  потенциальными  источниками  получения  лекарственных  субстанций.  В  частности,  большой  интерес  вызывают  растения,  обладающие  ярко  выраженным  антиоксидантным  действием.  Возникновение  и  развитие  различных  заболеваний,  например  злокачественных  опухолей,  инфаркта,  цирроза  печени,  заболеваний  нервной  системы  и  нарушений  в  функционировании  иммунной  системы,  обусловлено  действием  свободных  радикалов  на  клеточные  структуры  [2,  с.  47—54].  Свободные  радикалы  —  это  молекулы  или  частицы,  обладающие  неспаренными  электронами.  Среди  них  наиболее  опасны  активные  формы  кислорода.  Последние  инициируют  перекисное  окисление  жирных  кислот,  что  приводит  к  образованию  карбонильных  соединений,  связывающихся  с  нуклеиновыми  кислотами  и  белками.  Окисление  ненасыщенных  жирных  кислот  фосфолипидов  называется  перекисным,  потому  что  первичным  стабильным  продуктом  этого  процесса  являются  гидроперекиси  (ROOH).  В  результате  происходит  перекисная  деградация  молекул  фосфолипидов,  что  влечёт  за  собой  нарушение  структуры  клеточных  мембран  и  липопротеидов  [9,  с.  9—37].  Использование  ингибиторов  процесса  окисления  веществ  —  антиоксидантов,  необходимо  для  предотвращения  разрушающего  действия  свободных  радикалов.  К  растениям,  демонстрирующим  значительные  антиоксидантные  свойства,  относится  пажитник  греческий  (Trigonella  foenum-graecum  L.).  Большое  количество  исследований  показало,  что  экстракты,  полученные  из  надземной  части  и  семян  пажитника,  эффективно  нейтрализуют  свободные  радикалы  [8,  с.  96—99;  5,  с.  31—37;  6,  с.  337—697].  Наличие  данных  свойств  у  пажитника  греческого  создает  предпосылки  для  применения  данного  растения  в  фармацевтической  промышленности  с  целью  получения  лекарственных  препаратов.

Многообещающим  способом  получения  антиоксидантного  комплекса  пажитника  греческого  в  промышленных  масштабах  является  культура  клеток  in  vitro.  У  данного  метода  масса  преимуществ:  полная  независимость  культивирования  от  климатических  условия,  возможность  контроля  всех  этапов  производства  и  т.  д.  [3,  с.  20].  В  промышленной  биотехнологии  преимущественно  используются  суспензионные  культуры,  но  для  того  чтобы  их  использование  для  получения  конечного  продукта  было  экономически  оправданным,  они  должны  одновременно  характеризоваться  высокой  продуктивностью  по  биомассе  и  синтезируемым  целевым  соединениям  [1,  с.  123—160].

Целью  данной  работы  было  определить  антирадикальную  и  общую  антиоксидантную  активности  водно-спиртовых  экстрактов  биомассы  суспендированных  клеток  и  среды  инкубации  на  разных  этапах  роста  суспензионной  культуры  пажитника  греческого  для  установления  ее  антиоксидантного  потенциала.

Объектом  изучения  служила  суспензионная  культура  пажитника  греческого,  инициированная  из  гетеротрофного  каллуса  листового  происхождения  пажитника  ярового  сорта  Ovari  4  [4,  с.  29—37].  Определение  показателей  антиоксидантной  активности  суспензионной  культуры  на  4-е,  7-е,  11-е,  14-е,  18-е,  21-е,  24-е,  28-е  сут.  культивирования.

Общую  антиоксидантную  активность  оценивали  фосфомолибденовым  методом  с  небольшими  модификациями  [6,  с.  338—339].  Антирадикальную  активность  определяли  методом  DPPH  (2,2-дифенил-1-пикрилгидразил)  [7,  с.  3961—3980].  Общую  антиоксидантную,  антирадикальную  активности  суспензии  клеток  и  среды  культивирования  выражали  в  эквиваленте  аскорбиновой  кислоты  и  пересчитывали  на  г  сухой  массы  суспензии  (мг/г  сухой  массы).

Из  данных,  представленных  на  рисунке  1,  видно,  что  в  ходе  латентной  фазы  роста  суспензионной  культуры  пажитника  греческого  общая  антиоксидантная  активность  ее  экстрактов  составляла  11,25  мг/г  сухой  массы.

Рисунок  1.  Динамика  изменения  общей  антиоксидантной  активности  водно-спиртовых  экстрактов  суспензионной  культуры  пажитника  греческого  в  ходе  ростового  цикла

К  7  сут.  ростового  цикла  культуры  происходило  снижение  уровня  до  8,98  мг/г.  Далее,  начиная  с  11  сут.,  антиоксидантная  активность  экстрактов  культуры  повышалась,  достигнув  своего  максимума  на  18  сут.  культивирования  (16,37  мг/г).  После  чего  наблюдалось  небольшое  снижение  показателя  до  15,52  мг/г  на  28  сут.  выращивания  культуры.

Из  чего  следует,  что  в  суспензионной  культуре  пажитника  греческого  самый  низкий  уровень  общей  антиоксидантной  активности  экстрактов  приходится  на  начало  логарифмической  фазы  ростового  цикла,  а  самый  высокий  уровень  находится  в  фазе  замедления  и  в  стационарной  фазе  роста.

Также  были  проведены  исследования  динамики  изменения  общей  антиоксидантной  активности  в  среде  культивирования  суспензионной  культуры  пажитника  греческого  в  ходе  ростового  цикла  (рисунок  2).

Рисунок  2.  Динамика  изменения  общей  антиоксидантной  активности  среды  культивирования  суспензионной  культуры  пажитника  греческого  в  ходе  ростового  цикла

Из  данных,  представленных  на  рисунке  2,  видно,  что  в  ходе  культивирования  суспензионной  культуры  значительно  изменяется  восстановительная  способность  питательной  среды.  Так,  максимальное  значение  общей  антиоксидантной  активности  приходится  на  латентную  фазу  роста  (28,9  мг/г).  Далее  уровень  резко  снижается  и  достигает  своего  минимума  к  21  сут.  —  0,92  мг/г  сухой  массы.

Исследование  изменения  общей  антирадикальной  активности  экстрактов  суспензионной  культуры  пажитника  греческого  в  процессе  ее  выращивания  показало,  что  в  ходе  латентной  фазы  роста  (4  сут.)  антирадикальная  активность  была  самая  высокая  и  составляла  0,6  мг/г  (рисунок  3).

Рисунок  3.  Динамика  изменения  антирадикальной  активности  водно-спиртовых  экстрактов  суспензионной  культуры  пажитника  греческого  в  ходе  ростового  цикла

В  дальнейшем  значение  показателя  снизилось  до  0,26  мг/г  на  11  сут.  выращивания  культуры,  после  чего  уровень  нейтрализованных  свободных  радикалов  возрос  до  0,38  мг/г  на  21  сут.  культивирования,  далее  уровень  антирадикальной  активности  практически  не  изменялся.

Полученные  данные  свидетельствуют  о  том,  что  в  процессе  культивирования  суспензионной  культуры  пажитника  греческого  внутриклеточное  содержание  соединений  с  антирадикальными  свойствами  уменьшается,  что  влечет  за  собой  снижение  видимой  антирадикальной  активности  экстрактов  суспензии.  Таким  же  образом,  были  получены  данные  по  динамике  изменения  антирадикальной  активности  в  среде  культивирования  суспензионной  культуры  пажитника  греческого  в  ходе  роста  (рисунок  4).

Рисунок  4.  Динамика  изменения  антирадикальной  активности  среды  культивирования  суспензионной  культуры  пажитника  греческого  в  ходе  ростового  цикла

Из  рисунка  4  видно,  что  уровень  антирадикальной  активности  в  среде  культивирования  был  самым  высоким  на  4  сут.  культивирования  2,0  мг/г  сухой  массы.  Далее  уровень  соединений,  демонстрирующих  протон-донорную  активность,  резко  уменьшился  до  0,19  мг/г  на  18  сут.  В  последующем  значение  показателя  постепенно  увеличивается  стационарной  фазе  роста  до  0,32  мг/г  сухой  массы.

Таким  образом,  можно  заключить,  что  в  латентную  фазу  роста  в  суспензии  активно  вырабатываются  и  экскретируются  в  питательную  среду  соединения,  демонстрирующие  выраженную  восстановительную  и  радикал-ингибирующую  активности.  Причем  содержание  подобных  метаболитов  в  среде  на  данном  этапе  ростового  цикла  значительно  превышает  их  уровень  в  суспендированных  клетках.  В  процессе  роста  культуры  общая  антиоксидантная  и  антирадикальная  активности  среды  культивирования  значительно  снижаются.  При  этом  общая  антиоксидантная  активность  суспензии  клеток  возрастает,  а  ее  антирадикальная  активность  хотя  и  снижается,  но  в  гораздо  меньшей  степени,  чем  в  случае  среды  культивирования.

Список  литературы:

1.Бутенко  Р.Г.  Биология  клеток  высших  растений  in  vitro  и  биотехнологии  на  их  основе:  учеб.  пособие/  Р.Г.  Бутенко.  М.:  ФБК-ПРЕСС,  1999.  —  160  с.

2.Бобырев  В.Н.  и  др.  Специфичность  систем  антиоксидантной  защиты  органов  и  тканей  —  основа  дифференцированной  фармакотерапии  антиоксидантами/  Экспериментальная  и  клиническая  фармакология.  —  1994.  —  Т.  57,  —  №  1.  —  с.  47—54.

3.Дитченко  Т.И.  Культура  клеток,  тканей  и  органов  растений:  методические  рекомендации  к  лабораторным  занятиям  /  Т.И.  Дитченко,  Минск:  БГУ,  2000.  —  22  c.

4.Lohvina  H.O.,  Makai  S.,  Ditchenko  T.I.,  Reshetnikov  V.N.,  Spiridovich  E.V.,  Yurin  V.M.  Induction  of  callus  from  leaves  and  stems  of  Trigonella  foenum-graecum  varieties  //  Acta  Agronomica  Óváriensis.  —  2012.  —  v.  54  (2).  —  P.  29—37.

5.Kaviarasan  S.,  Naik  G.H.,  Gangabhagirathi  R.,  Anuradha  C.V.,  Priyadarsini  K.I.  In  vitro  studies  on  antiradical  and  antioxidant  activities  of  fenugreek  (Trigonella  foenum-graecum)  seeds  //  Food  Chemistry.  —  2007.  —  Vol.  103.  —  P.  31—37.

6.Prieto  P.,  Pineda  M.,  Aguilar  M.  Spectrophotometric  quantitation  of  antioxidant  capacity  through  the  formation  of  a  Phosphomolybdenum  Complex:  Specific  application  to  the  determination  of  vitamin  E  //  Anal.  Biochem.  —  1999.  —  Vol.  269.  —  P.  337—341.

7.Parthasarathy  S.,  Azizi  J.B.,  Ramanathan  S.,  Ismail  S.,  Sasidharan  S.,  Said  M.I.M.,  Mansor  S.M.  Evaluation  of  antioxidant  and  antibacterial  activities  of  aqueous,  methanolic  and  alkaloid  extracts  from  Mitragyna  Speciosa  (Rubiaceae  Family)  leaves  //  Molecules.  —  2009.  —  Vol.  14  (10).  —  P.  3964—3974.

8.Subhashini  N.,  Thangathirupathi  A.,  Lavanya  N.  Antioxidant  activity  of  trigonella  foenum-graecum  using  various  in  vitro  and  ex  vivo  models  //  International  Journal  of  Pharmacy  and  Pharmaceutical  Sciences.  —  2011.  —  Vol.  3.  —  №  2.  —  P.  96—102.

9.Weiss  J.J.  Oxygen,  ischemia  and  inflammation  //  Acta  Physiol.  Scand.  —  1984.  —  Suppl.  548.  —  P.  9—37.