МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ  ХАРАКТЕРИСТИКИ  СУСПЕНЗИОННОЙ  КУЛЬТУРЫ  ПАЖИТНИКА  ГРЕЧЕСКОГО

Драгун  Полина  Алексеевна

студент  5  курса,  кафедра  клеточной  биологии  и  биоинженерии  растений  БГУ,  Республика  Беларусь,  г.  Минск

E-mail: 

Логвина  Анна  Олеговна

научный  руководитель,  ассистент  кафедры  клеточной  биологии  и  биоинженерии  растений  БГУ,  Республика  Беларусь,  г.  Минск

Пажитник  греческий  (Trigonella  foenum-graecum  L.)  —  однолетнее  растение,  перспективность  применения  которого  в  профилактике  и  лечении  многих  заболеваний,  в  том  числе  диабета  2  типа  и  различных  форм  рака,  является  установленной  [4,  c.  500;  9,  c.  50—55].  Многочисленные  исследования  свидетельствуют  о  высоком  содержании  фенольных  соединений  в  экстрактах  листьев  и  семян  пажитника  [10,  с.  695—705;  6,  с.  143—147],  что  создает  предпосылки  для  применения  этого  растения  в  фармацевтической  промышленности  для  получения  данных  метаболитов.  Актуальной  задачей  является  разработка  и  внедрение  альтернативных  способов  получения  ценного  сырья  пажитника,  среди  которых  применение  биотехнологического  метода  культуры  клеток  и  тканей  растений  видится  многообещающим.  Перспективность  широкого  использования  данной  технологии  в  будущем  определяется  преимуществами,  которые  может  дать  производителям  выращивание  клеточных  культур  по  сравнению  с  классическими  способами  получения  фитомассы.  Наиболее  значимыми  из  таких  преимуществ  являются  полная  независимость  культивирования  от  климатических  условий  и  возможность  контролировать  все  этапы  производственного  процесса,  что  позволит  решить  проблему  дефицита  исходного  сырья  для  фармацевтической  промышленности  и  увеличить  масштабы  производства  лекарственных  препаратов  [5,  с.  300—350].  В  промышленной  биотехнологии  преимущественно  используются  суспензионные  культуры,  важным  этапом  исследования  которых  является  определение  характеристик,  отражающих  их  физиологическое  состояние. 

В  связи  с  этим  целью  данной  работы  было  определение  морфофизиологических  характеристик  суспензионной  культуры  пажитника  греческого  —  динамики  накопления  биомассы,  степени  агрегированности  и  жизнеспособности  на  разных  этапах  роста.

Объектом  изучения  служила  суспензионная  культура  пажитника  греческого,  инициированная  из  гетеротрофного  каллуса  листового  происхождения  пажитника  ярового  сорта  Ovari  4  [7,  с.  29—37].  Для  инициации  суспензионной  культуры  помещали  6—7  г  свежей  рыхлой  массы  каллусных  клеток  в  колбу  на  500  мл  с  200  мл  стерильной  жидкой  питательной  среды  [1,  с.  22],  соответствующей  по  составу  среде,  используемой  для  выращивания  данной  каллусной  ткани.  Среду,  минеральная  основа  которой  соответствовала  среде  Мурасиге  и  Скуга,  дополняли  регуляторами  роста:  1,0  мг/л  2,4-дихлорфеноксиуксусной  кислоты,  2,0  мг/л  кинетина  и  2,0  мг/л  индолил-3-уксусной  кислоты  [7,  с.  29—37].  Суспензию  культивировали  в  темноте  при  комнатной  температуре  на  круговой  качалке  со  скоростью  100—120  об/мин.  [1,  с.  22].

Для  получения  кривой  роста  суспензионной  культуры  пажитника  греческого  определяли  индекс  роста  [2,  c.  100].  С  этой  целью  в  колбы  на  250  мл  с  50  мл  свежей  питательной  среды  вносили  по  5  мл  суспензии  клеток.  Культивировали  в  течение  заданного  промежутка  времени  —  4-е,  7-е  ,  11-е,  14-е,  18-е,  21-е,  24-е,  28-е  сут.,  после  чего  суспензию  фильтровали  через  бумажный  фильтр,  сушили  в  течение  3  суток  при  60  °C  и  взвешивали.  Для  определения  начальной  массы  культуры  отбирали  5  мл  этой  же  суспензии,  фильтровали  через  бумажный  фильтр,  сушили  в  течение  3  суток  при  60  °C  и  взвешивали.  Определение  степени  агрегированности  и  жизнеспособности  суспензии  на  разных  этапах  роста  проводили  после  ее  окрашивания  нейтральным  красным  [1,  с.  22].

Измерения  проводили  на  протяжении  трех  пассажей.  Данные  на  графиках  представлены  в  виде  средних  значений  ±  стандартная  ошибка  средней. 

Модельная  кривая  роста  суспензии  клеток  имеет  S-образную  форму  и  включает:  лаг-фазу,  экспоненциальную  фазу,  фазу  замедления  роста,  стационарную  фазу  и  фазу  деградации.  Форма  реальных  ростовых  кривых  отличается  продолжительностью  фаз.  Скорость  нарастания  биомассы  колеблется  от  15  до  70  суток.  Это  зависит  от  генетики  популяции,  количества  инокулюма  и  состава  питательной  среды  [3,  c.  45]. 

Рисунок  1.  Кривая  роста  суспензионной  культуры  пажитника  греческого.  Фазы  роста:  1  —  латентная,  2  —  логарифмическая,  3  —  замедления,  4  —  стационарная

Из  графика,  представленного  на  рисунке  1,  видно,  что  латентная  фаза  ростового  цикла  культуры  продолжается  до  4  суток  выращивания.  С  5  суток  наблюдается  резкое  увеличение  ростовой  активности  культуры,  что  свидетельствует  о  ее  переходе  в  логарифмическую  фазу  роста,  продолжающуюся  вплоть  до  18  суток,  после  чего  рост  суспендированных  клеток  замедляется.  Следом  за  фазой  замедления  роста  (18—21сутки)  начинается  стационарная  фаза  роста,  где  дальнейшие  изменения  массы  клеток  незначительны  и  рост  культуры  стабилен.  Начиная  с  24  суток,  отмечается  тенденция  к  деградации  культуры.

Изучение  изменения  степени  агрегированности,  жизнеспособности  и  морфологии  суспендированных  клеток  в  процессе  культивирования  показало,  что  на  протяжении  роста  суспензионной  культуры  в  основном  преобладали  одиночные  клетки  и  мелкие  агрегаты  (рисунок  2).  Процентное  содержание  одиночных  клеток  от  общего  числа  фракций  составило  56  %  в  начале  ростового  цикла  (4  сут.).  К  21  сут.  культивирования  одиночных  клеток  количество  уменьшилось  до  37  %,  но  уже  на  24—28  сут.  количество  одиночных  клеток  было  равным  с  исходным  уровнем,  наблюдаемым  в  ходе  лаг-фазы.  Процентное  содержание  мелких  агрегатов  от  суммы  всех  типов  фракций  в  ходе  ростового  цикла  варьировало  в  относительно  меньших  пределах:  возрастало  от  26  %  на  4  сутки  до  37  %  на  14  сутки  культивирования.  После  чего  снизилось  до  31  %.  Что  касается  более  крупных  агрегатов,  то  содержание  средних  скоплений  клеток  возрастало  от  6  %  на  4  сут.  до  18  %  на  21  сут.,  после  чего  вплоть  до  28  сут.  выращивания  изменялось  несущественно.  Тогда  как  процент  крупных  агрегатов  от  общего  числа  фракций  повышался  от  1,5  %  в  ходе  лаг-фазы  роста  (4  сут.)  до  7  %  к  18  сут.,  но  далее  снижался  до  0,4  %  (28  сут.).

Анализ  жизнеспособности  культуры  показал,  что  количество  живых  одиночных  клеток  в  ходе  лаг-фазы  (4  сут.)  ростового  цикла  составляло  менее  половины  от  их  общего  числа.  Однако  в  процессе  роста  культуры  процентное  содержание  живых  одиночных  клеток  возрастало,  что  связано  с  их  активным  размножением  клеток  в  ходе  экспоненциальной  фазы.  В  итоге  во  время  стационарной  фазы  роста  (24—28  сут.)  практически  все  одиночные  клетки,  присутствующие  на  тот  момент  в  культуре,  были  живыми.  Жизнеспособность  всех  типов  агрегатов  на  протяжении  всего  роста  культуры  была  очень  высокой  и  изменялась  незначительно.

А

Б

В

Г

Рисунок  2.  Процентное  содержание  различных  фракций  клеток  в  ходе  ростового  цикла  суспензионной  культуры  пажитника  греческого.  А  —  одиночные  клетки,  Б  —  мелкие  агрегаты,  В  —  средние  агрегаты,  Г  —  крупные  агрегаты

Таким  образом,  можно  заключить,  что  ростовая  кривая  суспензионной  культуры  пажитника  греческого  имеет  стандартную  S-образную  форму.  Оптимальный  срок  выращивания  данной  культуры  составляет  от  21  до  24  суток.  В  ходе  ростового  цикла  суспензионной  культуры  пажитника  греческого  преобладающими  фракциями  являются  одиночные  клетки  и  мелкие  агрегаты.  Жизнеспособность  суспензии  высокая  и  возрастает  к  стационарной  фазе  ростового  цикла.

Список  литературы:

1.Дитченко  Т.И.  Культура  клеток,  тканей  и  органов  растений:  методические  рекомендации  к  лабораторным  занятиям  /  Мн.  БГУ.  2007.  —  22  c.

2.Загребельный  С.Н.  Биотехнология.  Часть  1.  Культивирование  продуцентов  и  очистка  продуктов.  Новосибирск.:  Новосиб.  гос.  ун-т,  2000.  —  108  с.

3.Сорокина  И.К.,  Старичкова  Н.И.,  Решетникова  Т.Б.,  Гринь  Н.А.  Основы  биотехнологии  растений.  Культура  клеток  и  тканей:  Учебное  пособие.  Новосибирск:  НГУ,  2002.  —  45  с.

4.Barnes  J.,  Anderson  L.A.,  Philipson  J.D.  Herbal  medicines  (3rd  ed).  London:  Pharmaceutical  Press,  2007,  —  710  p. 

5.Chawla  H.S.  Introduction  to  plant  biotechnology  (2nd  ed.).  Enfield:  Science  Publishers,  2002,  —  538  p.

6.Kaviarasan  S.,  Vijayalakshmi  K.,  Anuradha  C.V.  Polyphenol-rich  extract  of  Fenugreek  seeds  protect  erythrocytes  from  oxidative  damage.  Plant  Foods  for  Human  Nutrition,  —  2004,  —  vol.  59,  —  p.  143—147.

7.Lohvina  H.O.,  Makai  S.,  Ditchenko  T.I.,  Reshetnikov  v.N.,  Spiridovich  E.v.,  Yurin  v.M.  Induction  of  callus  from  leaves  and  stems  of  Trigonella  foenum-graecum  varieties  //  Acta  Agronomica  Óváriensis.  —  2012.  —  v.  54  (2).  —  P.  29—37.

8.Morton  J.F.  Mucilaginous  plants  and  their  uses  in  medicine.  J.  Ethnopharm,  —  1990,  —  vol.  29,  —  p.  215—266. 

9.Phadnis  M.,  Malhosia  A.,  Singh  S.M.,  Malhosia  A.  Therapeutic  effect  of  Fenugreek  seed  on  the  patients  suffering  from  diabetes  mellitus  type  II.  Journal  of  Biology,  Agriculture  and  Healthcare,  —  2011,  —  vol.  1,  —  №  2,  —  p.  50—55.

10.Premanath  R.,  Sudisha  J.,  Lakshmi  Devi  N.,  Aradhya  S.M.  Antibacterial  and  anti-oxidant  activities  of  Fenugreek  (Trigonella  foenum-graecum  L.)  leaves.  Res.  J.  Med.  Plant,  —  2011,  —  vol.  5,  —  №  6,  —  p.  695—705.