ПОЛИМОРФНЫЕ  ВАРИАНТЫ  ГЕНОВ  HLA-DRB1*1501  И  GPC5,  КАК  ГЕНЕТИЧЕСКИЙ  ФАКТОР  РИСКА  РАССЕЯННОГО  СКЛЕРОЗА

Ерыкалина  Инна  Александровна

студент,  Башкирский  Государственный  Педагогический  Университет,  РФ,  г.  Уфа

Туктарова  Ильсия  Авхатовна

научный  руководитель,  канд.  мед.  наук;  Учреждение  Российской  академии  наук  Институт  биохимии  и  генетики  Уфимского  научного  центра  РАН,  РФ,  г.  Уфа

E-mail:  InnaVesper31@gmail.com

Рассеянный  склероз  (РС)  —  многофакторное  полигенное  заболевание,  причем  значение  отдельных  генов  в  разных  популяциях  неодинаково.  С  целью  изучения  влияния  полиморфных  вариантов  генов  HLA-DRB1*1501  и  GPC5  на  формирование  рассеянного  склероза  с  учетом  половой  принадлежности  на  территории  Республики  Башкортостан  нами  обследовано  907  пациентов  с  РС  и  754  практически  здоровых  доноров.  Обнаружено,  что  rs3135388  [С/Т]  (HLA-DRB1*1501)  и  rs9523762  [A/G]  (GPC5)  предрасполагают  к  развитию  РС.  Так,  было  установлено,  что  маркерами  риска  развития  рассеянного  склероза  являются:  у  русских  —  генотип  HLA-DRB1*1501*С/*Т  (OR=1,71,  CI:  1,11-2,36)  и  алелль  HLA-DRB1*1501*Т  (OR=1,68,  CI:  1,16-2,42);  у  башкир  —  генотип  GPC5*A/*A  (OR=1,35,  CI:  1,02-1,96)  и  аллель  GPC5*A  (OR=1,48,  CI:  1,04-2,1).  Протективными  факторами  в  отношении  развития  РС  у  русских  является  генотип  HLA-DRB1*1501*С/*С  (OR=0,57,  CI:  0,38-0,86);  у  башкир  —  генотип  GPC5*G/*G  (OR=0,58,  CI:  0,34-1)  и  аллель  GPC5*G  (OR=0,67,  CI:  1,47-0,95).  Полученные  нами  данные  свидетельствуют  об  отсутствии  вклада  полиморфного  варианта  гена  GPC5  в  развитие  рассеянного  склероза  у  татар  из  РБ. 

Ключевые  слова:  рассеянный  склероз,  HLA-DRB1*1501,  GPC5,  полногеномный  анализ  ассоциаций  (GWAS),  Республика  Башкортостан,  полиморфные  варианты  генов

Рассеянный  склероз  (PС)  —  наиболее  распространенное  хроническое  заболевание  центральной  нервной  системы,  характеризующееся  разрушением  миелина  и  образованием  бляшек  в  белом  веществе  головного  и  спинного  мозга.  Данная  патология  представляет  собой  серьезную  медико-социальную  проблему,  так  как  поражает,  в  основном,  лиц  трудоспособного  возраста  и  служит  одной  из  главных  причин  инвалидизации  молодых  людей  [2].  По  распространенности  PC  занимает  четвертое  место  в  мире  среди  неврологических  заболеваний  после  инсультов,  паркинсонизма  и  эпилепсии  и  является  одной  из  наиболее  значимых  проблем  современной  неврологии  [2,  3,  5].  Общепринятым  остается  мнение,  что  PC  -  многофакторное  заболевание,  в  инициировании  и  развитии  которого  играют  роль,  как  генетические  факторы,  так  и  факторы  окружающей  среды  [4].  Роль  полиморфизмов  генов  HLA-DRB1  и  GPC5  в  формировании  наследственной  предрасположенности  к  РС  была  обоснована  результатами  полногеномных  скринингов,  проведенных  участниками  Международного  Консорциума  Генетики  Рассеянного  склероза  (Multiple  Sclerosis  Genetics  Consortium  —  IMSGC).  Полагают,  что  полиморфные  варианты  данных  генов  могут  вносить  вклад  в  развитии  РС,  но  необходима  репликация  результатов  анализа  ассоциации  этих  генов  в  популяциях  разных  народов  [9;  14].  Для  выявления  генетических  вариантов  подверженности  к  рассеянному  склерозу  исследовались  tagSNP  HLA-DRB1*1501  и  GPC5  (tagging  single  nucleotide  polymorphisms;  полиморфизм,  аллельные  варианты  которых  маркируют  гаплотипические  блоки). 

Цель  настоящей  работы  состояла  в  изучении  роли  полиморфных  вариантов  rs3135388  гена  HLA-DRB1*1501  и  rs9523762  гена  GPC5  для  прогнозирования  риска  развития  рассеянного  склероза.  Исследования  по  полиморфным  локусам  гена  HLA-DRB1*1501  в  этнической  популяции  русских  и  гена  GPC5  в  этнических  популяциях  русских,  татар  и  башкир,  проживающих  на  территории  Республики  Башкортостан,  ранее  не  проводились.

Материалы  и  методы

Выборка  больных  была  сформирована  из  907  индивидов,  русских  (50  %),  татар  (40  %)  и  башкир  (10  %)  по  этнической  принадлежности,  в  возрасте  от  28  до  54  лет  (средний  возраст  манифестации  заболевания  составил  28,63±0,56),  с  достоверным  диагнозом  РС,  проходивших  курс  лечения  в  Республиканской  клинической  больнице  им.  Куватова  г.  Уфы.  Соотношение  женщин  и  мужчин  среди  больных  было  3  к  1  у  русских,  1  к  1  у  татар,  2  к  1  у  башкир.  Контрольную  группу  составили  754  индивида  (из  них  45  %  —  русских,  25  %  —  татар,  30  %  —  башкир),  без  признаков  РС  и  других  неврологических  заболеваний. 

Анкетирование  и  сдача  венозной  крови  для  проведения  генетических  исследований  проводилось  с  письменного  согласия  исследуемых  людей.  Молекулярно-генетический  анализ  образцов  проводили  на  базе  ИБГ  УНЦ  РАН.

ДНК  выделяли  из    мл  цельной  венозной  крови  методом  фенольно-хлороформной  экстракции  [10].  Генотипирование  выполняли  методами  ПЦР  с  гибридизационно-флуоресцентной  детекцией  в  режиме  реального  времени  или  с  использованием  ПЦР/ПДРФ  анализа  (табл.  1).  Амплификацию  проводили  с  помощью  амплификатора  «Bio-Rad»  (США).

Статистическая  обработка  полученных  данных  проводилась  с  использованием  пакета  программ  ”Statistica  for  Windows”  5.0”(StatSoft)  и  программного  обеспечения  MS  Excel  2010.  При  попарном  сравнении  частот  аллелей  и  генотипов  в  группах  больных  и  контроля  использовался  критерий  c²  (р)  для  таблиц  сопряженности  2х2  с  поправкой  Йетса  на  непрерывность.  Силу  ассоциации  оценивали  в  значениях  показателя  соотношения  шансов  Odds  Ratio  (OR)  [1].

Таблица  1.

Характеристика  изученных  полиморфных  локусов

Результаты  и  обсуждения

Результаты  распределения  частот  аллелей  и  генотипов  полиморфных  локусов  rs3135388  гена  HLA-DRB1*1501  и  rs9523762  гена  GPC5  в  выборках  больных  РС  и  контроля,  русских.  татар  и  башкир  представлены  в  табл.  2—5. 

Согласно  литературным  источникам,  ген  HLA-DRB1  (6p.21.3)  принадлежит  главному  комплексу  гистосовместимости  (ГКГ)  и  кодирует  рецепторы  Т-лимфоцитов  [13].  В  результате  данной  SNP  происходит  срыв  аутотолерантности  организма  и  мишенью  для  Т-лимфоцитов  становится  миелин.

Сравнение  пациентов  с  РС  и  контроля  выявило  статистически  значимые  различия  в  распределении  частот  генотипов  полиморфного  маркера  rs3135388  гена  HLA-DRB1*1501  между  группами  больных  РС  и  контролем  в  зависимости  от  этнической  принадлежности  (р>0,05)  (табл.  2).

По  частотам  генотипов  группа  больных  РС,  русских  по  этнической  принадлежности,  отличается  от  контрольной  группы  той  же  этнической  принадлежности;  в  группе  больных  повышена  частота  генотипа  HLA-DRB1*1501*C/*T  (OR=1,71,  CI:  1,11-2,63,  р=0,015)  и  аллеля  HLA-DRB1*1501*T  (OR=1,68,  CI:  1,16-2,42,  р=0,006),  понижена  частота  генотипа  HLA-DRB1*1501*C/*C  (OR=0,57,  CI:  0,38-0,86,  р=0,008).  При  дифференциации  групп  по  признаку  половой  принадлежности,  обнаружены  статистически  значимые  различия  для  русских  мужчин  РБ:  шансы  развития  заболевания  повышены  у  лиц  с  генотипом  HLA-DRB1*1501*С/*Т  (OR=2,5,  CI:1,26-4,97)  и  понижены  с  генотипом  HLA-DRB1*1501*С/*С  (р=0,01  OR=0,43,  CI:  0,23-0,82)  (табл.  3).

Таблица  2.

Распределение  частот  генотипов  и  аллелей  полиморфного  локуса  rs3135388  гена  HLA-DRB1*1501  у  больных  РС  и  в  контрольных  группах

Примечание:  здесь  и  далее,  р  —  уровень  значимости  различий  между  группами

Таблица  3.

Распределение  частот  генотипов  и  аллелей  полиморфного  локуса  rs3135388  гена  HLA-DRB1*1501  у  больных  РС  и  в  контрольных  группах

Примечание:  здесь  и  далее,  м  —  мужчины,  ж  —  женщины

Полученные  нами  в  ходе  настоящего  исследования  полиморфного  локуса  rs3135388  гена  HLA-DRB1*1501  результаты,  подтверждают  данные  исследований,  проведенных  на  северо-европейских  популяциях  [7],  а  также  на  популяциях  из  США  [11]. 

Ген  GPC5  локализован  в  13q.32  области  и  на  высоком  уровне  экспрессируется  в  головном  мозге,  почках,  семенниках  и  гипофизе  [12].  Гены  глипиканов  играют  важную  роль  в  кодировании  аксонов  и  образовании  возбуждающих  синапсов  [6].

При  подсчете  соотношения  шансов  риска  развития  рассеянного  склероза  установлено,  что  генотип  GPC5*A/*A  (OR=1,35,  CI:  1,02-1,96,  р=0,16)  и  аллель  GPC5*A  являются  факторами  риска  развития  РС  у  башкир  (OR=1,48,  CI:  1,04-2,1,  р=0,03);  протективными  факторами  развития  РС  у  башкир  являются  генотип  GPC5*G/*G  (OR=0,58,  CI:  0,34-1,  р=0,05)  и  аллель  GPC5*G  (OR=0,67,  CI:  1,47-0,95,  р=0,03)  (табл.  4). 

По  частотам  генотипов  группы  больных  РС,  русских  и  татар  по  этнической  принадлежности,  не  имеют  статистически  значимых  отличий  с  контрольными  группами  тех  же  этнических  принадлежностей.  На  этом  основании  следует  полагать,  что  полиморфный  локус  rs9523762  гена  GPC5  не  ассоциирован  с  РС  у  русских  и  татар  (табл.  4).

Сопоставление  групп  с  учетом  гендерных  особенностей  позволило  обнаружить  несходство  в  распределении  частот  генотипов  и  аллелей  между  группой  больных  РС  и  здоровых  русских  мужчин  и  женщин  (табл.  5).  По  сравнению  с  контрольной  группой,  в  группе  больных  мужчин  понижена  частота  генотипа  GPC5*G/*G  (OR=0,51,  CI:  0,29-0,9,  р=0,022),  а  также  частота  аллеля  GPC5*G  (OR=0,7,  CI:  0,49-1,01,  р=0,065).  В  группе  женщин  по  полиморфному  локусу  rs9523762  гена  GPC5  не  обнаружено  статистически  значимых  различий  по  распределению  частот  генотипов  и  аллелей  между  группами  больных  РС  и  здоровых.

У  татар  при  подразделении  группы  больных  по  половой  принадлежности  не  выявлено  ассоциаций  полиморфного  локуса  rs9523762  гена  GPC5  с  заболеванием  (табл.  5).

Таблица  4.

Распределение  частот  генотипов  и  аллелей  полиморфного  локуса  rs9523762  гена  GPC5  у  больных  РС  и  в  контрольных  группах

Таблица  5.

Распределение  частот  генотипов  и  аллелей  полиморфного  локуса  rs9523762  гена  GPC5  у  больных  РС  и  в  контрольных  группах  с  учетом  половой  принадлежности

Результаты,  полученные  в  процессе  данной  работы,  совпадают  с  результатами  исследований  GWAS  на  РС,  проведенных  в  Испании,  целью  которых  явилось  определение  новых  биаллельных  маркеров  вне  HLA  —  области,  участвующих  в  восприимчивости  к  заболеванию  [8].

Заключение

Проведенное  исследование  подтвердило,  что  полиморфные  варианты  rs3135388  гена  HLA-DRB1*1501  и  rs9523762  гена  GPC5  являются  факторами  риска  развития  рассеянного  склероза  у  генетически  предрасположенных  индивидуумов  в  популяциях  русских  и  башкир  РБ.

Отсутствие  ассоциации  полиморфного  локуса  rs9523762  гена  GPC5  в  популяции  татар  в  нашем  исследовании,  может  говорить  как  об  отсутствии  связи  выбранного  полиморфного  локуса  с  развитием  РС  у  жителей  Республики  Башкортостан,  так  и  о  недостаточной  мощности  исследования. 

Список  литературы:

1. Гланц  С.  Медико-биологическая  статистика  /  Пер.  с  англ.  /  Под  ред.  Н.Е.  Бузикашвили  и  Д.В.  Самойлова.  М.:  Практика,  1999.  —  460  с.
2. Гусев  Е.И.,  Бойко  А.Н.,  Завалишин  И.А.  Рассеянный  склероз  и  другие  демиелинизирующие  заболевания.  М,  2004;  6-103.
3. Гусев  Е.И.,  Бойко  А.Н.,  Завалишин  И.А.  и  др.  Эпидемиологические  исследования  рассеянного  склероза.  Методические  рекомендации  МЗ  РФ  №  2003/82,  М.  2003,  —  80  с.
4. Завалишин  И.А.,  Головкин  В.И.  Рассеянный  склероз.  М.  Медицина,  2000.
5. Завалишин  И.А.,  Захарова  М.Н.  Рассеянный  склероз:  современные  аспекты  этиологии  и  патогенеза.  Журн.  неврологии  и  психиатрии.  2003.  приложение  №  2.  —  С.  10—12.
6. Allen  N.J.,  Bennett  M.L.,  Foo  L.C.,  Wang  G.X.,  Chakraborty  C.,  Smith  S.J.,  Barres  B.A.,  2012.  Astrocyte  glypicans  4  and  6  promote  formation  of  excitatory  synapses  via  GluA1  AMPA  receptors.  Nature  486,  410—414.
7. Benešová  Y.,  Vašků  A.,  Štourač  P.,  Hladíková  M.,  Fiala  А,  Bednařík  J.  Association  of  HLA-DRB1*1501  tagging  rs3135388  gene  polymorphism  with  multiple  sclerosis.  Journal  of  Neuroimmunology  255  (2013)  92—96.
8. Cavanillas  ML,  Fernández  O,  Comabella  M,  Alcina  A,  Fedetz  M,  Izquierdo  G,  Lucas  M,  et  al.  Replication  of  top  markers  of  a  genome-wide  association  study  in  multiple  sclerosis  in  Spain.  Genes  Immun.  2011.
9. Comabella  M.,  David  W.  Craig.,  Morcillo  C.,  Lopez  C.,  et  al.  Identification  of  a  Novel  Risk  Locus  for  Multiple  Sclerosis  at  13q31.3  by  a  Pooled  Genome-Wide  Scan  of  500,000  Single  Nucleotide  Polymorphisms.  Plosone.  10,  2008.
10. Johns  M.,  J.  Paulus-Thomas.  Purification  of  human  genomic  DNA  from  whole  blood  using  proteinase  K  treatment  followed  by  phenol-chlorophorm  extraction  //  Anal.  Biochem.  —  1989.  —  V.  180.  —  P.  276—278.
11. Hafler  D.A.,  Compston  A.,  Sawcer  S.,  Lander  E.S.,  Daly  M.J.,  De  Jager,  et  al.,  2007.  International  Multiple  Sclerosis  Genetics  Consortium,  2007.  Risk  alleles  for  multiple  sclerosis  identified  by  a  genomewide  study.  N.  Engl.  J.  Med.  357,  851—862.
12. Saunders  S.,  Paine-Saunders  S.,  Lander  A.D.,  1997.  Expression  of  the  cell  surface  proteoglycan  glypican-5  is  developmentally  regulated  in  kidney,  limb,  and  brain.  Dev.  Biol.  190,  78—93.
13. Sreeram  V.  Ramagopalan,  Narelle  J.  Maugeri,  Lahiru  Handunnetthi,  et  al.  Expression  of  the  Multiple  Sclerosis-Associated  MHC  Class  II  Allele  HLA-DRB1*1501  Is  Regulated  by  Vitamin  D.  PLoS  Genetics,  2,  2009.
14. Willer  CJ,  Dyment  DA,  Sadovnick  AD,  Rothwell  PM,  Murray  TJ,  et  al.  (2005)  Timing  of  birth  and  risk  of  multiple  sclerosis:  population  based  study.  Bmj  330:  120.