ЦИТОТОКСИЧЕСКАЯ И АНТИВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ СИНТЕТИЧЕСКИХНУКЛЕОЗИДНЫХ АНАЛОГОВ  НА ВЭБ-ИНФИЦИРОВАННЫЕ КЛЕТКИ

Иванченко Дмитрий Анатольевич

студент 6 курса, ННЦ “Институт биологии” КНУ им  Т Шевченка, г  Киев

E-mail: 003-1192@qt.net.ua

Загородняя Светлана Дмитриевна

научный руководитель, канд. биол. наук,

старшый научный сотрудник Института микробиологии и вирусологии им  Д. К.  Заболотного НАНУ,

г. Киев

Вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ) является широко распространенным гаммагерпесвирусом человека, который латентно персистирует практически у 100 % населения земного шара [1, с. 481‑492]. Механизм передачи ВЭБ – аэрозольный, путь передачи – воздушно-капельный. Возможна передача вируса при трансфузии крови, особенно в случае трансплантации органов [2, с. 79‑93]. В семействе Herpesviridae ВЭБ уникальный по своей способности вызывать не цитолиз, а размножение инфицированных клеток – В-лимфоцитов, поскольку он пожизненно персистирует в них. При первичном инфицировании ВЭБ заболевание обычно протекает бессимптомно, а в случае реактивации может приводить к возникновению доброкачественных лимфопролиферативных заболеваний и злокачественных опухолей. В странах с умеренным климатом ВЭБ вызывает такие заболевания как инфекционный мононуклеоз, в условиях тропиков вызывает  лимфому Беркитта, а в странах Азии  – назофаренгиальную карциному [3, c. 65‑70].

На сегодня, наиболее разработанной является химиотерапия ациклическими  нуклеозидами.  Данная  группа   препаратов  представлена ​​синтетическими аналогами природных нуклеозидов. Подавление репликации вирусов усиливается при использовании аналогов нуклеозидов, которые наиболее часто повторяются в конечных и внутренних цепях вирусной ДНК и любое изменение нуклеотидов в цепи ДНК или ее разрывы приводят к генетическому повреждению ДНК [4, с. 5‑11]. Принципы лечения ВЭБ-инфекции разработаны в значительно меньшей степени по сравнению с другими герпесвирусными инфекциями и при этом в латентной фазе вирусной инфекции трансформированные клетки менее чувствительны к действию противовирусных препаратов. Исходя из приведенного выше, разработка препаратов для лечения ВЭБ-инфекции и определения их эффективности, является важным и актуальным [5, с. 240‑243].

По своей структуре исследуемые веществаподобные тимидинуи представлены дигетероциклическимисоединениями. Первое гетерокольцо–  производное 1,2,3-триазола с трифторметильним заместителем в 4-м положении и тиосульфатним остатком в 5-м положении. Второе кольцо представлено остатком циклогексана или циклопентана, которые содержат различные заместители. Трифторметильна группа введена вместо метильной, которая должна отдавать протоны водорода, остается неизменной и таким образом тормозит ферментативные реакции. Поэтому введение атома фтора не вызывает заметных стерических препятствий и не затрудняет взаимодействие таких модифицированных фтором соединений с соответствующими активными центрами ферментов.Триазолы– органические соединения класса гетероциклов, пятичленный цикл с тремя атомами азота и двумя атомами углерода в цикле. Триазолывступают в реакции электрофильного замещения по атомам углерода или азота. Кроме трифторметила в 4-м положении 1,2,3-триазол исследуемых соединений также содержит остаток тиосульфата в 5-м положении. Тиосульфаты – соли или сложные эфиры тиосирчаной кислоты (H2S2O3). Химические свойства тиосульфатом обусловлены легкостью разрыва S-S связи под действием нуклеофильных и электрофильных реагентов [6, с. 4185‑4194].Присутствие в структуреисследованых синтетических циклических и ациклических нуклеозидных аналоговпиримидинового гетероцикла обусловливает способность к образованию комплементарных пар с основаниями ДНК и РНК, а гетероциклическое ядро исследованых веществ устойчивое к кислотному и щелочному гидролизу, действию восстановителей и окислителей, а также метаболической деградации под действием энзимов [7, с. 3‑46]. В то же время эти гетероциклы могут активно участвовать в образовании водородных связей, а также диполь-дипольных и стэкинг-взаимодействиях [8].

Целью данной работы было исследование цитотоксической и антивирусной активности синтетических нуклеозидных аналогов на ВЭБ-инфицированные клетки.

Культура клеток Raji– лимфобластоидные клетки В-фенотипа, которые содержат геном ВЭБ но синтезируют только ранние антигены вируса.

Цитотоксичность исследуемых веществ, при которой жизнеспособность клеточной популяции Raji снижалась на 50 % (показатель СС50) определяли с помощью двух методов, а именно с использованием 0,4% раствора трипанового синего и также колориметрическим методом МТТ [9, с. 936‑942]. При исследовании цитотоксичности соединений в концентрациях от 15,6 до 1000 мкг/мл с использованием красителя трипанового синего, который способен проникать через мембрану мертвой клетки и красить ее в синий цвет, при этом живые клетки остаются прозрачными оказалось, что наименее токсичным веществом является соединение № 1, которое в наибольшей исследуемой концентрации 1000 мкг/мл снижает жизнеспособность клеточной популяции на 51 %, а наиболее токсичным оказалось соединение № 3, уже концентрация 500 мкг/мл приводит к 97 % гибели клеточной популяции. По проведенному исследованию цитотоксичности веществ при окраске красителем трипановым синим  установлено, что СС50для соединения № 1 составляет 955 мкг/мл,          № 2 – 605 мкг/мл, №3 – 350 мкг/мл. Параллельно исследовали цитотоксичность соединений в этом же диапазоне концентраций методом МТТ и установили, что СС50для соединения № 1 составляет > 1000 мкг/мл, № 2 – 550 мкг/мл, № 3 – 325 мкг/мл. Таким образом, сравнивая результаты МТТ-теста и трипанового синего обнаружены близкие по значению показатели, т.е. наиболее токсичным является соединение № 3, а наименее токсичным – № 1.

Также нами был проведен сравнительный анализ подавление накопления ДНК вируса Эпштейна-Барр после воздействия синтетических циклических и ациклических нуклеозидных аналоговс помощью полуколичественного метода ПЦР, используя тест-систему "AMPLY-Senc-100" (Россия) и программу обработки результатов "Biotest A". В качестве праймеров используется участок генома   ВЭБ,   который   кодирует   капсидный   белок   вируса  (VCA)  размером290 п. н. Амплифицированный специфический фрагмент ДНК выявляли методом электрофореза в агарозном геле в присутствии бромистого этидия [10, c. 248].

В результате проведенных исследований показано, что анализируемые вещества № 1 и № 2 ингибируют репликацию ВЭБ в среднем на 20 % в диапазоне концентраций от 0,1 до 10 мкг/мл.При этом соединение № 1 в концентрацияхот 0,1 до 1 мкг/мл и с 1 до 10 мкг/мл ингибируетрепликациювируса лишь на 4 %,тогда как при обработке соединением№ 5 в исследуемом диапазоне наблюдается снижение ингибирования накопления вирусной ДНК с 20 % до 18 %.Для соединения № 3 показано четкое дозозависимое действие. В концентрациях 0,1 и 1 мкг/мл уровень репликации ВЕБ подавляется на 20 % и 28 % соответственно, а при внесении 10 мкг/мл наблюдается 100 % ингибирования. Вещество № 3 имеет выраженное противируcное действие in vitro – его эффективная концентрация (EС50), т.е. концентрация, которая ингибирует репликацию ВЭБ на 50 % составила 4 мкг/мл. Соединения № 1 и № 2 необходимо исследовать в более высоких концентрациях, чтобы определить показатели EС50.По соотношению CC50и ЕC50определено, что индекс селективности для ациклического нуклеозидного аналога (вещество  № 3) становит 80 [11, с. 371–395, 527].         Таким образом, исходя из полученных результатов экспериментальных исследований, можно сделать вывод о существенном влиянииациклического етоксиетильного фрагмента на уровень репликации вируса Эпштейна-Барр. Вещество № 3 (миметик ациклического нуклеозидного аналога) почти в 4 раза эффективнее № 2 и в 5 раз за № 1 (оба – миметики циклических нуклеозидных аналогов), но при этом токсичность вещества № 3 в отношении клеток Raji в 2 и почти в 3 раза выше, чем у соединений № 2и № 1, соответсвенно.

Список литературы:

1. Cohen J. I. Epstein-Barr  virus  infection.  // N. Engl. J. Med. – 2000. – Vol. 343.  – P. 481‑492.
2. Волоха А. П., Чернишова Л. І.  Епштейна-Барр  вірусна   інфекція  у  дітей.  // Сучасні інфекції. – К. – 2003. – № 4. – C. 79‑93.
3. Блохина Е. Б. Рольлатентнойинфекции,вызванной вирусомЭпштейна-Баррв развитии лимфопролиферативных заболеваний. // Вопросы гематологии / онкологии и  иммунопатологии в педиатрии. – 2003. – Т. 2. – № 3. – C. 65‑70.
4. Ершов Ф. И. Антигерпетики // Герпес. – 2006. – № 1. – C. 5‑11.
5. Галегов Г. А. Лекарственная терапия герпесвирусной инфекции: фундаментальные аспекты и современные клинические достижение. // Consilium medicum.– 2002. – T. 4. – № 5. – C. 240‑243.
6. Alvarez R.,Velazquez S.,San-Felix A.,Aquaro S.,De Clercq E.,Perno C. F.,Karlsson A., Balzarini J., Camarasa M. J. 1,2,3-Triazole-[2',5'-bis-O-(tert-butyldimethylsilyl)-beta-D-ribofuranosyl]-3'-spiro-5"-(4"-amino-1",2"-oxathiole 2",2"-dioxide) (TSAO) analogues: synthesis and anti-HIV-1 activity. //J. Med. Chem.– 1994. – V. 37. – P. 4185‑4194.
7. Yamazaki T., Taguchi T., Ojima I. “Unique Properties of Fluorine and Their Relevance to Medicinal Chemistry and Chemical Biology”. Fluorine in Medicinal Chemistry and Chemical Biology: Ojima, I., Ed., John Wiley & Sons. // New York. –  2009. – P. 3‑46.
8. Rachwal S., Katritzky A. 1,2,3-Triazoles. Comprehensive Heterocyclic. // Chemistry III. – 2008. – V. 5.       
9. Carmicheal J. Evaluation  of tetrazolium-based semi-automated colorimetric assay:  assessment  of  chemosensitivity  testing. // Cancer Research. – 1987. – №. 47.  – P. 93‑942.
10. Остерман П. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. // М.: МЦНМО, 2002. – 248 c.
11. Щербінська A. M., Дяченко Н. С., Рибалко С. Л., Носач Л. М., Дядюн С. Т., Вринчану Н. О. Вивчення антивірусної дії потенційних лікарських засобів // Доклінічні     дослідження      медичних     засобів:    Метод.    рек.    За    ред. О.В. Стефанова. – К.: Авіценна, 2001. – 371–395, 527 c.