ПРИМЕНЕНИЕ  МОДУЛЯ  ЮНГА  ДЛЯ  ХАРАКТЕРИСТИКИ  ДЕФОРМАЦИИ  РИЗОБАКТЕРИЙ

Артамонова  Марина  Николаевна

ассистент  кафедры  общей  и  клинической  фармакологии  с  курсом  микробиологии  Ульяновского  государственного  университета,  РФ,  г.  Ульяновск

E-mail:  artamonovamn2013@yandex.ru

Пчелинцева  Екатерина  Сергеевна

канд.  физ.-мат.наук,  начальник  лаборатории  зондовой  и  электронной  микроскопии  Научно-исследовательского  технологического  инстититута  Ульяновского  государственного  университета,  РФ,  г.  Ульяновск

E-mail:  nanolabniti@gmail.com

Костишко  Борис  Борисович

мл.  науч.  сотр.  лаборатории  зондовой  и  электронной  микроскопии  Научно-исследовательского  технологического  инстититута  Ульяновского  государственного  университета,  РФ,  г.  Ульяновск

E-mail:  nanolabniti@gmail.com

Потатуркина-Нестерова  Наталия  Иосифовна

д-р  мед.  наук,  профессор  кафедры  общей  и  клинической  фармакологии  с  курсом  микробиологии  Ульяновского  государственного  университета,  РФ,  г.  Ульяновск

E-mail: 

APPLICATION  OF  YOUNG  ^,S  MODULUS  FOR  THE  DEFORMATION  CHARACTERISTICS  OF  RHIZOBACTERIA

Artamonova  Marina  Nikolaevna

assistant  of  Department  of  General  and  Clinical  Pharmacology  with  the  course  of  Microbiology  of  Ulyanovsk  State  University,  Russia  Ulyanovsk

Pchelintseva  Yekaterina  Sergeevna

candidate  of  science,  Head  of  Laboratory  scanning  probe  and  electron  microscopy  of  Research  Technology  institute  of  Ulyanovsk  State  University,  Russia  Ulyanovsk

Kostishko  Boris  Borisovich

junior  research  fellow  of  Laboratory  scanning  probe  and  electron  microscopy  of  Research  Technology  institute  of  Ulyanovsk  State  University,  Russia  Ulyanovsk

Potaturkina-  Nesterova  Natalia  Iosifovna

doctor  of  Medicine,  professor  of  Department  of  General  and  Clinical  Pharmacology  with  the  course  of  Microbiology  of  Ulyanovsk  State  University,  Russia  Ulyanovsk

АННОТАЦИЯ

Целью  работы  явилось  изучение  упруго-механических  свойств  мембраны  ризобактерий  методом  атомно-силовой  спектроскопии  в  режиме  силовой  спектроскопии.  В  ходе  исследования  было  установлено,  что  модуль  упругости  бактериальных  клеток  изменяется  в  зависимости  от  режима  культивирования.  Модуль  Юнга  изменялся  обратно  пропорционально  относительно  температуры.  Показатели  модуля  Юнга  ризобактерий  1  группы  (культивируемых  при  +5⁰С)  составил  3,6±0,1  Мпа,  2  группы  (0⁰С)  —  5,1±0,7  Мпа,  3  группы  (–5⁰С)  —  6,0±1,1  Мпа.  При  снижении  температуры  культивирования  происходило  уменьшение  размеров  бактериальных  клеток.  Установлено,  что  сила  адгезии  также  зависит  от  температурного  фактора  и  достоверно  увеличивалась  при  снижении  температуры.

ABSTRACT

The  purpose  of  the  research  was  studying  the  elastic  and  mechanical  properties  of  the  rhizobacteria  membrane  with  atomic  force  spectroscopy  in  mode  force  spectroscopy.  It  has  been  found  that  the  elastic  modulus  of  the  bacterial  cells  dependend  on  temperature.  Young's  modulus  was  inversely  proportional  to  temperature.  Еthe  elastic  modulus  of  rhizobacteria  in  group  №1  (  cultured  at  50⁰  C)  was  3,6  ±  0,1  MPa,  in  group  №  2  (0  ⁰C  )  —  5,1  ±  0,7  MPa,  in  group  №3  (–50  ⁰C  )  —  6,0  ±  1,  1  Mpa.  It  has  been  reducing  the  size  of  the  bacterial  cells  when  the  temperature  of  cultivation  decreased.  It  has  been  established  that  the  adhesion  force  was  also  dependent  on  the  temperature  factor  ,  and  it  increased  when  the  temperature  decreased.

Ключевые  слова:  модуль  Юнга;  упруго-механические  свойства  бактерий;  ризобакетрии;  сила  адгезии.

Keywords:  Young's  modulus;  elasto-mechanical  properties  of  the  bacteria;  rhizobacteria;  adhesion  force.

Одним  из  наиболее  общих  интегральных  показателей  структурно-функционального  состояния  бактерий  и  их  мембран  являются  вязко-эластические  свойства,  изучение  которых  стало  возможным  благодаря  использованию  атомно-силовой  микроскопии  [5,  6].  Упругость  и  вязкость  являются  фундаментальными  механическими  свойствами  микроорганизмов,  определяющими  их  функциональность  [2,  c.  14].  Известно,  что  структурные  трансформации  в  мембране  приводят  к  изменению  её  упругости  с  последующей  деформацией  клетки  [3,  c.  54]. 

Упруго-эластические  свойства  бактерий  обеспечивают  их  устойчивость  к  действию  абиотических  факторов  окружающей  среды  [3,  c.  55].  Среди  физико-химических  факторов,  влияющих  на  рост  и  размножение  микроорганизмов,  наибольшее  значение  имеет  температура.  Большинство  ризосферных  микроорганизмов  являются  мезофилами  с  оптимумом  роста  при  26—30  °С.  При  температуре  ниже  оптимальной  на  5—10  °С  бактерии  не  погибают,  однако,  происходит  изменение  структуры  бактерий  и  задержка  их  размножения.

Известны  такие  методы  измерения  вязкоупругих  характеристик  клеток  микроорганизмов,  как  прямой  метод  с  применением  микроманипуляционной  техники,  оптический,  основанный  на  регистрации  изменений  светорассеяния  микробных  суспензий,  и  метод  инородных  включений  [2,  c.  73].  Однако  все  они  имеют  ряд  недостатков,  ограничивающих  их  применение  в  работе  с  микроорганизмами.  Имеются  единичные  сообщения  о  применении  для  характеристики  механических  свойств  бактериальных  мембран  атомно-силовой  спектроскопии,  основанный  на  измерении  степени  деформации  поверхности  при  её  взаимодействии  с  вершиной  зонда  атомно-силового  микроскопа  [1,  с.  68].  Данный  метод  позволяет  проводить  измерение  модуля  упругости  (модуля  Юнга)  и  на  основе  этого  производить  расчет  степени  деформации  микроорганизмов. 

Целью  работы  явилась  характеристика  степени  деформации  мембраны  ризобактерий  Cucurbita  pepo  L.  на  основе  определения  модуля  Юнга  при  атомно-силовой  микроскопии.

Материалы  и  методы  исследования

В  работе  было  изучено  24  штамма  бактерий,  выделенных  из  ризосферы  Cucurbita  pepo  L.  Штаммы  ризобактерий  культивировали  в  жидкой  питательной  среде  LB  (Danies,  Россия),  содержащей  агар  до  2,25  %  и  выдерживали  при  температуре  37  ⁰  С  в  течение  10  ч  [10].

Упруго-механические  свойства  ризобактерий  изучали  в  стационарной  фазе  роста  (10—18  ч  культивирования)  при  различных  температурных  показателях:  +5⁰  С  (1  группа),  0⁰  С  (2  группа),  –5⁰  С  (3  группа). 

Исследования  проводили  с  использованием  сканирующего  зондового  микроскопа  Solver  P47-PRO  (NT-MDT,  Россия)  при  помощи  зондов  с  золотым  напылением  серии  NSG10  (NT-MDT,  Россия)  размером  95х30  мкм,  с  жесткостью  балки  17  Н/м,  радиусом  закругления  иглы  10  нм.  Анализ  морфометрических  показателей  полученных  изображений  проводили  с  использованием  штатного  программного  обеспечения  микроскопа  Debug  Nova  1.1.0.1847.

При  определении  упругих  свойств  бактериальных  клеток  происходит  снятие  зависимостей  прогиба  кантилевера  от  расстояния  между  концом  иглы  и  поверхностью  образца.  Получаемые  в  процессе  измерений  так  называемые  «кривые  подвода»  представляют  собой  графическое  отображение  зависимости  отклонения  кантилевера  от  его  перемещения  по  вертикальной  оси  Z.  Алгоритм  исследования  включал  в  себя  предварительное  получение  кривых  подвода  с  объекта,  упругость  которого  превышает  константу  упругости  кантилевера  (kc).

Предполагается,  что  движение  сканера  по  оси  Z  (Δz)  сопровождается  пропорциональным  отклонением  кантилевера  (Δd).  В  свою  очередь  в  случае  «мягкого»  образца  (ko<kc)  отклонение  кантилевера  оказывается  несимметричным  движению  сканера  (Δz>Δd),  поскольку  поверхность  объекта  «продавливается»  зондом.  Зарегистрированные  показатели  в  дальнейшем  используются  для  вычисления  глубины  продавливания  как  δ=Δz-Δd  с  последующим  расчетом  модуля  Юнга  по  модели  Герца,  описывающей  контактную  деформацию  двух  тел.  При  этом  исходная  формула(1)  выражала  зависимость  между  действующей  на  объект  силой  (F)  и  глубиной  его  продавливания  (δ):

  ,  (1) 

где:  F  —  приложенная  сила, 

E  —  модуль  Юнга,  характеризующий  упруго-эластические  свойства  ЦПМ  бактерий, 

ν  —  коэффициент  Пуассона, 

δ  —  продавливание, 

R  —  радиус  иглы.  Коэффициент  Пуассона  для  бактериальных  клеток  равен  0,5. 

Статистическую  обработку  данных  производили  с  использованием  программ  “Microsoft  Excel”  и  “Statistika  6.0”.  Оценку  статистической  значимости  полученных  результатов  осуществляли  с  помощью  t-  критерия  Стьюдента.

Результаты  исследования.

В  ходе  исследования  было  установлено,  что  структурно-механические  свойства  ризобактерий  изменялись  в  зависимости  от  температуры  их  культивирования. 

Бактериальные  клетки  1  группы  оказывались  менее  упругими  по  сравнению  с  ризобактериями  2  и  3  группы.  Показатели  модуля  Юнга  ризобактерий  1  группы  составил  3,6±0,1  Мпа,  2  группы  —  5,1±0,7  Мпа,  3  группы  —  6,0±1,1  Мпа  (рис.  1).

Рисунок  1.  Показатели  модуля  Юнга  при  различных  температурных  режимах  культивирования

В  ходе  исследования  было  также  установлено,  что  в  зависимости  от  температуры  изменяются  морфометрические  параметры  ризобактерий. 

В  процессе  культивирования  ризобактерий  при  снижении  температуры  бактериальные  клетки  уменьшались  в  размерах.  В  1  группе  линейные  размеры  бактериальных  клеток  составляли  1,86х0,92  нм,  во  2  группе  —  1,38х0,59  нм  и  в  3  группе  —  0,94х0,45  нм  (рис.  2).

Изменение  морфометрических  параметров  ризобактерий  при  снижении  температуры  сопровождалось  изменением  силы  адгезивного  взаимодействия.

Динамика  адгезивной  активности  оказалась  обратно  пропорциональной  изменению  температурного  фактора.  Сила  адгезии  бактерий  1  группы  составила  544,0±59,8  нН.  При  снижением  температуры  адгезивное  взаимодействие  достоверно  увеличивалось,  и  во  2  и  3  группах  сила  адгезии  составила  2250,8±51,3  нН  (р<0,05)  и  5849,0±73,4  нН  (р<0,05)  соответственно  (рис.  2).

Рисунок  2.  Изменение  показателей  силы  адгезивного  взаимодействия  ризобактерий  от  температуры

Таким  образом,  установлено,  что  снижение  температуры  в  процессе  культивирования  влияет  на  структурно-механические  и  морфологические  свойства  ризобактерий.  Показатель  Юнга  изменялся  обратно  пропорционально  относительно  температуры.  Уровень  модуля  упругости  ризобактерий  возрастал  в  1,  2  и  3  группах  как  1<1,4<1,7  соответственно.  При  снижении  температуры  культивирования  происходило  достоверное  уменьшение  размеров  бактериальных  клеток  (р<0,05). 

Снижение  температуры  сопровождалось  повышением  показателей  силы  адгезии.  Так,  при  +5  ⁰С  адгезивная  сила  ризобактерий  составила  544,0  нН;  при  0  ⁰С  и  –5⁰С  —  показатели  силы  адгезии  увеличились  в  4,1  и  10,7  раза  соответственно. 

Список  литературы:

1.Васильченко  А.С.,  Яруллина  Д.Р.,  Никиян  А.Н.,  Тесля  А.В.  Морфофункициональные  характеристики  Bacillus  cereus  на  различных  этапах  жизненного  цикла//Вестник  ОГУ.  —  2012.  —  №  10.  —  С.  66—71.

2.Кобелев  А.В.,  Смолюк  Л.Т.,  Кобелева  Р.М.,  Проценко  Ю.Л.  Нелинейные  вязкоупругие  свойства  биологических  тканей.  Екатеринбург:  УрО  РАН,  2011.  —  244  с.

3.Лебедев  Д.В.,  Чукланов  А.П.,  Бухараев  А.А.,  Дружинина  О.С.  Измерение  модуля  Юнга  биологических  объектов  в  жидкой  среде  с  помощью  специального  зонда  атомно-силового  микроскопа//Письма  в  ЖТФ.  —  2009.  —  Т.  35.  —  Вып.  8.  —  С.  54—61.

4.Яминский  И.В.,  Пышкина  О.А.,  Сергеев  В.Г.,  Семенов  А.Э.,  Филонов  А.С.  Визуализация  прокариотических  клеток  с  помощью  атомно-силовой  микроскопии//  Зондовая  микроскопия-97:  Всероссийское  совещание  по  зондовой  микроскопии.  1997.  —  С.  124—127. 

5.Deng  Z.,  Lulevich  V.,  Liu  F.-t.,  Liu  G.-y.  Applications  of  Atomic  Force  Microscopy  in  Biophysical  of  Cells  //  J.  Phys.  Chem.  B.  —  2011.  —  Vol.  114.  —  №  18.  —  P.  5971—5982.

6.Francis  L.W,  Lewis  P.D.,  Wright  C.J.,  Conlan  R.S.  Atomic  force  microscopy  comes  of  age  //  Biol.Cell.  —  2010.  —  Vol.  102,  —  №  2.  —  P.  133—143.

7.Heinz  W.F.  and  Hoh  J.H.  Spatially  resolved  forse  spectroscopy  of  biological  surfices  using  the  atomic  force  microscope.  Trends  Biotechnol.,  —  1999a,  —  v.  17,  —  p.  143—150.